王海臣 王宏 劉偉超 呂菊保 沙洪

300192天津，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所

650 nm低能量激光照射離體高血脂全血和紅細胞對其吸收光譜的影響

王海臣 王宏 劉偉超 呂菊保 沙洪

300192天津，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所

目的 研究低能量激光照射離體高血脂全血和紅細胞對其吸收光譜的影響。方法 選取30例高血脂患者血樣為高血脂組，30例正常血樣為正常組，用多功能酶標儀分別對血樣的全血和紅細胞進行掃描，比較兩個樣本吸收光譜的異同；選用低能量650 nm激光照射待測血樣，用多功能酶標儀對全血和紅細胞進行掃描并比較照射前后吸收光譜的變化。結(jié)果 高血脂血樣的全血和紅細胞在416、544、578 nm處的吸收峰值均比正常血樣高，因此，可通過光譜吸收峰初步判定血液中血脂異常的情況。650 nm激光照射30例高血脂血樣后，紅細胞在416、544、578 nm處峰值分別降低，照射前后差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；全血照射后其吸收光譜在416、544、578 nm升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 650 nm低能量激光照射可降低高血脂紅細胞對光譜的吸收峰，且有助于改善紅細胞膜-漿脂質(zhì)的平衡，從光譜學角度證明了激光治療高血脂疾病的可行性。

低能量激光； 高血脂； 吸收光譜； 多功能酶標儀

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81602800,81301288)

0 引 言

高血脂又稱血脂紊亂或血脂異常，是指人體內(nèi)血清（血漿）脂質(zhì)濃度超出了正常范圍[1]。高血脂癥是一類較常見的疾病，除少數(shù)是由于全身性疾病所致外，絕大多數(shù)是因遺傳基因缺陷或與環(huán)境因素相互作用引起的。高血脂是誘發(fā)動脈血管粥樣硬化以及心腦血管等多種疾病的重要因素，因此改善體內(nèi)血脂水平是治療高血脂的關鍵環(huán)節(jié)[2-3]。對于血脂的治療，臨床上有各種療法，如抽脂手術[4]、針灸治療[5]、藥物治療、激光治療[6]等。其中激光治療效果顯著，目前未發(fā)現(xiàn)副作用。自20世紀90年代以來，低能量激光照射療法（low-level laser therapy，LLLT）引入我國，此療法是利用激光的生物學效應調(diào)整機體的免疫系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)和組織代謝系統(tǒng)等，使病例狀態(tài)恢復正常的一種療法[7]。低能量激光照射在以下方面效果顯著：①改善紅細胞變形能力和紅細胞剛性。②提高紅細胞載氧能力，加速血氧結(jié)合[8]。③糾正微循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強免疫能力[9]。④提高組織修復能力[10-11]。國際上以臨床研究為依據(jù)，各種治療高血脂手段的研究層出不窮，雖然多數(shù)研究結(jié)果證明激光治療是治療高血脂癥的可行性手段，但其詳細作用機理的研究并不充分[12-13]。本研究旨在利用低能量激光照射對生物組織作用產(chǎn)生生物效應，激光照射離體血液后，觀察全血及紅細胞對光譜吸收的變化來分析血脂的改變，從而為低能量激光照射改善高血脂人群的血脂水平提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院檢驗科正常血樣30例（膽固醇濃度＜5.72 mmol/L、甘油三酯濃度＜1.70 mmol/L）；高血脂血樣30例（膽固醇濃度＞5.72 mmol/L和/或甘油三酯濃度＞1.70 mmol/L）。60例樣本中女性23例，年齡為25～78歲，平均年齡為（68.5±13.5）歲，采用肝素抗凝。將性別、年齡、血細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)以及血小板經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），膽固醇、甘油三酯含量差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

0.9%生理鹽水（浙江齊敏制藥），肝素（上海源葉生物科技有限公司）。全波長多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），日立7100全自動生化分析儀（日本Hitachi公司），Pentra全自動血液分析儀（法國ABX公司），HES-TBD550紅細胞分離液（上海通善生物科技有限公司），KA-1000型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠制造），650 nm雙波長半導體激光器（中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所激光醫(yī)學實驗室研制）。

1.2.2 血樣的選取

選取醫(yī)院中用全自動生化分析儀測出的30例高血脂血樣和30例血脂正常血樣各4 ml，其中高血脂含量標準符合衛(wèi)生部頒發(fā)的《中藥新藥治療高血脂的臨床研究指導原則》。用全自動血液分析儀主要檢測血樣的紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、紅細胞壓積等。采用肝素（1 000 U/ml）抗凝，并將血樣保存于（4±2）℃，作為實驗待測液。

1.2.3 低能量激光照射

將正常血樣設為正常組，高血脂血樣設為高血脂組。高血脂組與正常組分別用波長為650 nm激光照射，調(diào)整激光參數(shù)，使激光器輸出功率密度為20 mW/cm2，激光能量密度為12 J/cm2。將血樣輕輕混勻，吸取1 ml至干凈的24孔板中，標記對應的血樣編號；將激光器和光纖連接好，并調(diào)整好激光照射位置，使激光最亮的光斑對準孔板的正中間位置，關閉日光燈；將24孔板放在照射臺上，每孔照射15 min，每5分鐘搖動孔板一次，以保證血樣照射均勻；然后吸取照射后的血樣0.5 ml進行紅細胞分離，分離的紅細胞與剩下的0.5 ml全血樣本稀釋之后用酶標儀進行光譜掃描。

1.2.4 紅細胞的分離和提取

將待測分離血樣按體積比1∶1與生理鹽水混合稀釋；然后再按體積比1∶1加入細胞分離液，置于塑料離心管中，1 500 r/min離心10 min，去除上清液，重復3次，即得紅細胞分離液；吸取0.5 ml紅細胞于干凈的離心管中，標記對應的血樣編號。

1.2.5 酶標儀掃描

用0.9%生理鹽水將全血及全血分離得到的紅細胞稀釋60倍，加至96孔板中，用多功能酶標儀掃描全血及紅細胞并繪制圖譜，統(tǒng)計全血及紅細胞吸收光譜的特性；比較正常組與高血脂組激光照射前后全血和紅細胞吸收光譜的不同之處，觀察吸收峰值的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 全血與紅細胞吸收光譜的特點

在200～1 000 nm波段正常組與高血脂組無論是全血還是紅細胞均在200～270 nm范圍內(nèi)吸光度值跳動很大，且隨機噪聲影響很大，270 nm之后才開始穩(wěn)定；各自的變化趨勢和峰值出現(xiàn)的波長位置基本相同，符合可見光段吸收光譜特征[14]。在（416.47±1.85）、（544.95±1.80）、（578.63±2.00）nm處有明顯的吸收峰，正常血樣與高血脂血樣的吸收光譜僅存在波峰量上的差異；在（345.00±1.00）nm處也存在吸收峰，在600～1 000 nm處其吸收率＜5%，且無特征吸收峰（圖1）。由表1可得出高血脂組比正常組的吸收峰要高，以416nm處最為明顯。

圖1 正常組與高血脂組全血和紅細胞的吸收光譜

表1 正常組與高血脂組光譜吸收測量結(jié)果（x±s）

2.2 低能量激光照射高血脂血樣

用650 nm激光照射高血脂組，激光照射前后的可見光吸收光譜特征無明顯變化；照射后的全血光譜吸收峰較照射前高，在吸收峰416、544、578 nm處，照射前后的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；照射后紅細胞光譜吸收峰在416、544、578 nm處較照射前低，且照射前后差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中在吸收峰416 nm差異更為突出。（表2）

表2 高血脂組全血與紅細胞照射前后光譜吸收變化情況（±s）

表2 高血脂組全血與紅細胞照射前后光譜吸收變化情況（±s）

注：與照射前比較，aP＜0.05

項目 組別 n 波長（nm）416 544 578全血 照射前 30 2.64±1.04 1.01±0.37 1.12±0.40照射后 30 3.36±1.11a 1.16±0.35a 1.19±0.36a紅細胞 照射前 30 3.85±0.94 1.32±0.20 1.35±0.21照射后 30 3.11±0.91a 1.34±0.37a 1.10±0.28a

2.3 低能量激光照射正常血樣

用650 nm激光照射正常組，激光照射前后的可見光吸收光譜特征無明顯變化。照射后的全血光譜吸收峰比照射前偏低，但照射前后差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；同時照射后的紅細胞光譜吸收峰在416、544、578 nm處較照射前相比，其差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此可見，650 nm低能量激光照射正常血樣對血樣的吸收光譜并無太大的影響。（表3）

表3 正常組全血與紅細胞照射前后光譜吸收變化情況（x±s）

3 討論

影響血液吸收光譜中可見光吸收峰的主要因素為血紅蛋白，國內(nèi)外相關研究均表明全血與紅細胞的吸收光譜基本一致。全血和紅細胞分別在波長為345、416、544、578 nm附近存在吸收峰[15]（圖1），符合血紅蛋白可見光吸收光譜的特征。由于本研究采用的是離體血液，因此血紅蛋白處于非氧合狀態(tài)，表現(xiàn)為非氧合血紅蛋白特征。在200～1 000 nm吸收光譜中，峰值為200～275 nm之間很容易破壞蛋白分子，導致血紅蛋白失去活性，因此在此波段光譜吸收跳動很大；而當激光波長超過800 nm就會減少血細胞的載氧能力。據(jù)臨床經(jīng)驗，波長為630～670 nm的激光治療效果最好，氦氖弱激光照射通常選用的波長為632.8 nm，此時紅細胞的載氧能力強，對于血液流變學的改善效果明顯。

本研究證明，可利用血液的吸收光譜特征來反映血脂的異常情況，在全血的吸收光譜中，吸收光譜特征并未改變，而高血脂組比正常組的吸光度偏高，在吸收峰416、544、578 nm附近尤為明顯（圖1）。對于高血脂組，在300～700 nm間其整體吸收峰偏高，主要是由于其血液中甘油三酯和膽固醇的含量比正常血液中多。王樂新等[16]在對高甘油三酯血清吸收光譜的研究中發(fā)現(xiàn)，高甘油三脂血清光譜的吸收率要高于正常血清的吸收率，其主要吸收范圍為370～600 nm，最強的吸收峰波長位于416 nm，且在538 nm與575 nm附近有2個較弱的吸收峰，但這2個波峰在正常血清的吸收光譜中并不明顯。蘭秀風等[17]的研究表明，高膽固醇血清的主要吸收范圍為375～600 nm，其吸收率是正常血清的2.2倍，其中最強的吸收峰位于波長416 nm處，在544 nm及578 nm處有2個較弱的吸收峰，這2個吸收峰在正常血清的吸收光譜中亦不明顯。因此，根據(jù)吸收光譜特征可初步判定血液中的血脂含量是否異常。

本研究中對紅細胞進行吸收光譜檢測，高血脂組較正常組紅細胞的吸收峰要高。紅細胞的脂質(zhì)占其總質(zhì)量的40%，其中磷脂和游離膽固醇約占其總脂的95%，還有少量的甘油酯和游離脂酸，以分子來計數(shù)，紅細胞膜中的磷脂和膽固醇相近。膽固醇主要分布在紅細胞膜的外層，也有一部分嵌入脂質(zhì)雙層，它具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用，紅細胞和血漿之間的脂質(zhì)分子處于平衡體系，需要膜-漿脂質(zhì)交換來維持平衡[18]。血脂升高，血漿中膽固醇的濃度即升高，膽固醇就會從高濃度的血漿中流入紅細胞脂質(zhì)層，結(jié)果紅細胞膽固醇含量升高對其光譜吸收產(chǎn)生了影響，使得高血脂組紅細胞的吸收峰偏高。

本研究結(jié)果顯示，用低能量650 nm激光照射可降低紅細胞對光譜的吸收。低能量激光照射高血脂血樣，使得紅細胞膜表面的脂質(zhì)分子減少，推測是由于經(jīng)低能量激光照射，可調(diào)節(jié)多種與脂質(zhì)代謝有關酶的活性，促進脂肪細胞釋放細胞內(nèi)的脂質(zhì)[19]，改善紅細胞與血漿的脂質(zhì)平衡，從而進一步改善了紅細胞的變形性和聚集性

4 結(jié)論

本研究表明，通過低能量激光照射可降低高血脂血液中紅細胞對光譜的吸收，間接反映出激光在治療高血脂方面的療效，激光治療通過減少紅細胞表面的脂質(zhì)分子，進而有助于改善紅細胞膜的變形性及流動性等血液流變學。未來尚需對低能量激光照射高血脂癥紅細胞的形態(tài)及功能變化的機理做進一步的研究。

利益沖突 無

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Influence of absorption spectrum with 650 nm low-level laser irradiation on in-vitro hyperlipidemia blood and erythrocyte

Wang Haichen,Wang Hong,Liu Weichao,Lyu Jubao,Sha Hong

Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China

Sha Hong,Email:shahong2000@163.com

Objective To study the effect on absorption spectrum of low-level laser irradiation on hyperlipidemia blood and erythrocyte in vitro.Methods A total of 30 hyperlipidemia blood samples were chosen as the experiment group,and 30 normal blood samples were chosen as the control group.The absorption spectrum of whole blood and erythrocyte in the two groups was measured by multi-wavelength microplate reader and compared. After hyperlipidemia and normal blood samples were irradiated by 650 nm low-level laser,the absorbance of whole blood and erythrocyte was measured,and the results were compared with those of hyperlipidemia and normal blood samples before irradiation.Results The absorption peaks(416,544,578 nm)of whole blood and erythrocyte in the experiment group were higher than those in the control group,which was considered as a diagnostic factor of hyperlipidemia.After low-level laser irradiation,the absorption peaks of erythrocyte at 416,544,and 578 nm in the experiment group decreased with significant differences(P＜0.05),while the absorption peaks of whole blood at 416, 544,and 578 nm in the experiment group were elevated with significant differences(P＜0.05).Conclusions Lowlevel laser irradiation at 650 nm can decrease the hyperlipidemia erythrocyte absorption peaks and improve the balance between erythrocyte membrane and lipid profiles,which proves the feasibility of low-level laser for the treatment of hyperlipidemia from the perspective of spectroscopy.

Low-level laser;Hyperlipidemia;Absorption spectrum;Multifunctional microplate reader

沙洪，Email：shahong2000@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．05．005

國家自然科學基金（81602800，81301288）

2016-07-12）