李寧,劇建格,于宏偉,賈英民(.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定0700;2.河北科技大學(xué),河北石家莊05008)
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抗菌肽產(chǎn)生菌Brevibacillus laterosporus S62- 9最適發(fā)酵條件的優(yōu)化
李寧1,劇建格1,于宏偉1,賈英民2,*
(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定071001;2.河北科技大學(xué),河北石家莊050018)
摘要:探討側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對產(chǎn)抗菌肽的影響,通過單因素試驗(yàn),確定了3個顯著因素,采用正交試驗(yàn)對產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化,并確定了最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明,S62-9產(chǎn)抗菌肽的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件:糊精1%、蛋白胨2%、CaCl20.15%、Tween-201.5%;起始pH為7.0,裝液量為40mL/300mL,以3%的接種量于37℃,250r/min搖床培養(yǎng)22h。在此條件下產(chǎn)抗菌肽較優(yōu)化前相比提高了59.9%。
關(guān)鍵詞:側(cè)孢短芽孢桿菌;抗菌肽;發(fā)酵條件;優(yōu)化
由細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌肽是近年來人們廣泛研究的一種生物防腐劑。能夠產(chǎn)生抗菌肽的細(xì)菌種類繁多,將其作為天然生物防腐劑用于食品工業(yè)的多集中在乳酸鏈球菌素(nisin)[1-2]。側(cè)孢短芽孢桿菌是細(xì)菌素的一個新來源[3],其產(chǎn)生的抗菌肽具有耐熱性高、抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn),在食品保藏中具有廣闊的應(yīng)用前景[4-5],國外相關(guān)的研究報道較少[6-7]。國內(nèi)有關(guān)側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的研究也愈來愈廣泛[8-10]。本試驗(yàn)以營養(yǎng)肉湯(NB)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn),以期最終獲得側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9產(chǎn)抗菌肽的最佳培養(yǎng)基組成和最佳發(fā)酵條件。
1.1材料
1.1.1菌株
側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9(Brevibacillus laterosporus S62-9):由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2主要培養(yǎng)基
1)斜面培養(yǎng)基:蛋白胨1 %,牛肉膏0.3 %,NaCl 0.5 %,瓊脂1.5 %~2 %,pH調(diào)至7.2~7.4,121℃20 min;
2)種子培養(yǎng)基:蛋白胨1 %,牛肉膏0.3 %,NaCl 0.5 %,pH調(diào)至7.2~7.4,121℃20 min;
3)發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精1%、蛋白胨2%、CaCl20.15%、Tween-20 1.5 %,pH調(diào)至7.2~7.4,121℃20 min。
1.2方法
1.2.1抑菌活性的測定
抗菌肽抑菌活性的測定采用瓊脂擴(kuò)散法[11]。以S. aureus為指示菌,用無菌生理鹽水將其稀釋到107cfu/mL,取1 mL指示菌菌懸液置于直徑為90 mm的標(biāo)準(zhǔn)平板中,再準(zhǔn)確吸取20 mL冷卻至40℃~50℃的營養(yǎng)瓊脂倒入板中混勻,使之形成均勻一致的指示菌平板。用直徑6 mm打孔器在指示平板上打孔,向孔中加入發(fā)酵上清液50 μL,置于37℃恒溫靜置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測量透明圈直徑(mm)。
1.2.2產(chǎn)抗菌肽發(fā)酵條件的優(yōu)化[12-13]
利用斜面培養(yǎng)基活化菌株S62-9,37℃培養(yǎng)18 h,后接種一環(huán)于種子培養(yǎng)基中(裝液量50 mL/300 mL),37℃、200 r/min培養(yǎng)18 h制成種子液,以2 %接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(裝液量為50 mL/300 mL),37℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。
1.2.2.1培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化
在發(fā)酵培養(yǎng)基中,依次添加不同碳源、氮源、無機(jī)鹽以及表面活性劑,測定抑菌活性,以不加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照(CK),設(shè)對照的抑菌直徑為100 %。確定出單因素組分和添加量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)糊精、蛋白胨、Tween-20和CaCl24個因素,每個因素設(shè)3個水平,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),通過L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,尋找最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分[11-12]。正交試驗(yàn)因素水平表如下:
表1正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table
1.2.2.2發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化
在優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,分別選擇不用的起始pH、發(fā)酵溫度、接種量以及溶氧量,其它條件不變,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),測定抑菌活性。
2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化
2.1.1不同碳源的影響
不同碳源對產(chǎn)抗菌肽的的影響如表2所示。
碳源是培養(yǎng)基的主要成分之一,適合的碳源對菌體的生長以及抑菌肽的的產(chǎn)生具有重要作用。分別選取2種單糖(葡萄糖、甘露醇)、3種雙糖(麥芽糖、蔗糖和乳糖)和2種多糖(糊精和殼聚糖)以1 %的添加量進(jìn)行研究。由表2可以看出,甘露醇和麥芽糖對抑菌肽的產(chǎn)生有抑制作用,而糊精卻有利于抗菌肽的產(chǎn)生。
表2不同碳源對產(chǎn)抗菌肽的的影響Table 2 Effect of different carbon source on production of antibacterial peptide
糊精添加量對產(chǎn)抗菌肽的影響如圖1所示。
圖1糊精添加量對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.1 Effect of dextrin on antibacterial pepide
通過進(jìn)一步試驗(yàn)(圖1)可知,1%的糊精添加量抑菌活性最高。但隨添加量的增加,反而抑制了抑菌活性。
2.1.2不同氮源的影響
不同氮源對產(chǎn)酶的影響如表3所示。蛋白胨添加量對產(chǎn)抗菌肽的影響如圖2所示。
表3不同氮源對產(chǎn)酶的影響Table 3 Effect of different nitrogen source on production of antibacterial peptide
由表3可知,各種氮源對抗菌肽的產(chǎn)生均有一定的促進(jìn)作用,其中蛋白胨對產(chǎn)抗菌肽有較大影響,而KNO3和NH4SO4對抗菌肽的產(chǎn)生也有一定的促進(jìn)作用。圖2表明,抑菌活力隨著蛋白胨添加量的增加而升高,當(dāng)增加到3.0 %時,抑菌活力有所下降。
2.1.3無機(jī)鹽的影響
無機(jī)鹽對產(chǎn)抗菌肽的影響如圖3所示,CaCl2對產(chǎn)抗菌肽的影響如圖4所示。
圖2蛋白胨添加量對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.2 Effect of peptone on antibacterial pepide
圖3無機(jī)鹽對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on antibacterial pepide
圖4 CaCl2對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.4 Effect of CaCl2on antibacterial pepide
無機(jī)鹽在微生物的生長繁殖和代謝過程中是不可缺少的,并對細(xì)胞內(nèi)外的pH,氧化還原電位和滲透壓具有調(diào)節(jié)作用。
由圖3和圖4可知,CaCl2對抗菌肽的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用,且添加量在0.01%~0.15%時,抑菌活性隨CaCl2添加量的增加逐漸升高,0.15%濃度時抑菌活性最大。隨著CaCl2濃度繼續(xù)增加,抑菌活性反而逐漸下降。2.1.4表面活性劑的影響
在培養(yǎng)基中加入表面活性劑Tween-80、Tween-20有利于抗菌肽的產(chǎn)生。結(jié)果如圖5、圖6所示。
兩種表面活性劑均對產(chǎn)抗菌肽有促進(jìn)作用,添加1.0 %的Tween-20時抑菌活性最高。作為乳化劑,Tween可降低細(xì)菌菌體與培養(yǎng)基之間的表面張力,從而改善微生物細(xì)胞膜的通透性,提高了細(xì)胞膜的通透性、刺激了抗菌肽的產(chǎn)生。
圖5表面活性劑對產(chǎn)抗菌肽影響Fig.5 Effect of surfactants on antibacterial pepide
圖6 Tween-20添加量對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.6 Effect of Tween-20 on antibacterial pepide
2.1.5培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,設(shè)計正交試驗(yàn)來綜合考慮糊精、蛋白胨、CaCl2和Tween-20對產(chǎn)抗菌肽的影響,見表3、表4。
表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test L9(34)
表4正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of Orthogonal test
由表3中的極差值可知,CaCl2對產(chǎn)抗菌肽的影響最大,其次是糊精,蛋白胨及Tween-20影響最小。產(chǎn)抗菌肽的最優(yōu)組合是A2B1C2D3,即1 %糊精、2 %蛋白胨、0.15 % CaCl2和1.5 % Tween-20。根據(jù)單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果,確定培養(yǎng)基的優(yōu)化配比為:1 %糊精、2 %蛋白胨、0.15 %CaCl2以及1.5 % Tween-20。
2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化
2.2.1初始pH的影響
由于搖瓶中培養(yǎng)基的pH在發(fā)酵過程中一直在變化,不易控制。方便起見,試驗(yàn)中只考慮培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)抗菌肽的影響。分別設(shè)定發(fā)酵液起始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,固定其它發(fā)酵條件,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),測定抑菌活性。初始pH的對產(chǎn)抗菌肽影響如圖7所示。
圖7初始pH的對產(chǎn)抗菌肽影響Fig.7 Effect of initial pH on antibacterial pepide
由圖7可知,發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜起始pH在7.0~8.0范圍內(nèi),抑菌活性較高。pH不僅會對發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物產(chǎn)生物理化學(xué)的影響,還會對產(chǎn)物穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。因此確定發(fā)酵液的初始pH為7.0。
2.2.2培養(yǎng)溫度的影響
溫度對微生物生長繁殖的有較大影響[14]。將發(fā)酵溫度分別設(shè)定為25、30、37℃和42℃,固定其它發(fā)酵條件,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),測定抑菌活性。培養(yǎng)溫度對產(chǎn)抗菌肽的影響如圖8所示。
圖8培養(yǎng)溫度對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.8 Effect of culturing temperature on antibacterial pepide
從圖8可知,菌株S62-9在37℃時抗菌肽活性最高,因此確定37℃為產(chǎn)抗菌肽的最適發(fā)酵溫度。
2.2.3最佳接種量的確定
接種量分別設(shè)定為1 %、2 %、3 %、4 %、5 %和6 %,固定其它發(fā)酵條件,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),12 h后測定抑菌活性。接種量對產(chǎn)抗菌肽的影響如圖9所示。
圖9接種量對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.9 Effect of inoculation on antibacterial pepide
由圖9可知,當(dāng)接種量達(dá)到3 %時,抗菌肽的活性最高。因此,確定S62-9發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的最佳接種量為3 %。
2.2.4溶氧量的影響
適量的氧氣供給有利于菌體的生長和代謝,供氧不足或供氧過多都會嚴(yán)重地影響微生物的生理代謝。在搖瓶條件下,溶解氧的高低可以通過改變?nèi)瞧康难b液量和搖床轉(zhuǎn)速來控制。結(jié)果如圖10和圖11。
側(cè)胞短芽孢桿菌S62-9是兼性厭氧菌,提高培養(yǎng)基中的溶氧量有利于抗菌肽的合成,鑒于搖床的承受能力,確定轉(zhuǎn)速為250 r/min,液量為40 mL/300 mL最利于抗菌肽的產(chǎn)生。
圖10轉(zhuǎn)速對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.10 Effect of shaking rate on production of antibacterial peptide
圖11裝液量對產(chǎn)抗菌肽的影響Fig.11 Effect of liquid volume on production of antibacterial pepide
本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn),獲得側(cè)胞短芽孢桿菌S62-9產(chǎn)抗菌肽的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件:糊精1 %、蛋白胨2 %、CaCl20.15 %、Tween-20 1.5 %;起始pH為7.0,裝液量為40 mL/300 mL,以3 %的接種量于37℃,250 r/min搖床培養(yǎng)22 h。在此條件下產(chǎn)抗菌肽較優(yōu)化前相比提高了59.9 %。結(jié)果表明,對發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽影響最顯著的是CaCl2,當(dāng)濃度在0.01 %~0.15 %時,抗菌肽活性隨添加量的增加而升高,但當(dāng)濃度大于0.15 %時,抑菌活性反而下降。其原因可能是因?yàn)镃a2+是抗菌肽合成酶必不可少的輔助因子,對抗菌肽的生物合成起到調(diào)節(jié)作用。Ca2+濃度在一定范圍內(nèi)能夠促進(jìn)抗菌肽的合成,而高濃度Ca2+不利于抗菌肽的合成。該結(jié)果與童應(yīng)凱等人的研究結(jié)果一致[15]。糊精對發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽影響顯著,可能是菌株利用糊精速度緩慢,可在代謝過程中形成酸性環(huán)境;而在菌體生長后期,仍有足夠的碳源從而有利于抗菌肽的積累。本試驗(yàn)中培養(yǎng)基起始pH對發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽具有較大的影響,初始pH在7.0~8.0范圍時發(fā)酵液中抗菌肽的抑菌活性較高,pH過高或過低均不利于抗菌肽的產(chǎn)生。
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Studies on the Fermentation Conditions of Antibacterial Peptide from Brevibacillus laterosporus S62-9
LI Ning1,JU Jian-Ge1,YU Hong-Wei1,JIA Ying-min2,*
(1. College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,Hebei,China;2. Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,Hebei,China)
Abstract:The optimal medium compositions and the optimal cultural conditions of antibacterial peptide produced by Brevibacillus laterosporus S62-9 were discussed. Different factors were investigated such as the ingredients of medium,temperature,pH,inoculating amount and medium capacity on production of antibacterial peptide in order to optimize fermentation condition of S62-9. The optimal results were dextrin 1 %,peptone 2 %,CaCl20.15 %,Tween-20 1.5 %. Through shake-flask experiments,the best culture conditions were pH 7.0,40 mL/300 mL,250 r/min and 3 % inoculation,37℃for 22 h. Cultured in this condition,the yield of antibacterial peptide increased 59.9 % compared with initial fermentative conditions.
Key words:Brevibacillus laterosporus;antibacterial peptide;fermentation conditions;optimization
收稿日期:2014-10-27
*通信作者:賈英民(1961—),男(漢),教授,博士生導(dǎo)師,從事食品微生物研究。
作者簡介:李寧(1980—),女(漢),副研究員,在讀博士研究生,研究方向:食品微生物。
基金項(xiàng)目:河北省自然基金項(xiàng)目“側(cè)孢短芽孢桿菌抗菌肽對食源性金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理研究”(C2014208137)
DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.046