宋國林，母昌考，李榮華，王春琳

(寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

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Cd2+對三疣梭子蟹的毒性效應研究

宋國林，母昌考*，李榮華，王春琳

(寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

摘要:本研究以三疣梭子蟹Portunus trituberculatus為研究對象，通過急性和亞急性暴露試驗，研究Cd(2+)對其肝胰腺和鰓的毒性效應。結果表明：Cd(2+)對三疣梭子蟹的48、72和96 h半致死質量濃度分別為6.55、4.33和3.12 mg/L，Cd(2+)對三疣梭子蟹的安全質量濃度為0.31 mg/L；在安全質量濃度和漁業(yè)水質標準質量濃度(<0.005 mg/L)下，隨著暴露時間的延長，三疣梭子蟹的肝胰腺和鰓中HSP70的表達量都出現(xiàn)“先升后降”的趨勢，與對照組相比，鰓中HSP70的表達量比肝胰腺的變化明顯。在安全質量濃度以下，三疣梭子蟹的存活率并沒有明顯的變化，但是HSP70的誘導表達反映機體受到Cd(2+)的脅迫。因此HSP70基因可用作低質量濃度Cd(2+)污染檢測的生物標志物。

關鍵詞:三疣梭子蟹；Cd(2+)；急性毒性實驗；HSP70

0引言

重金屬污染是漁業(yè)環(huán)境污染的公害之一。重金屬鎘是一種廢水中常見的污染物，當水中含Cd2+0.1 mg/L時，就會抑制地面水的自凈作用[1]，對生物體的危害較大，可引起生物肝臟、泌尿系統(tǒng)等的功能變化，同時Cd2+還具有環(huán)境雌激素及環(huán)境內分泌干擾物質的效應[2]。三疣梭子蟹Portunustrituberculatus是一種重要的海洋經(jīng)濟動物，隸屬甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，是中國沿海的重要經(jīng)濟蟹類。因其經(jīng)濟價值高、營養(yǎng)豐富、生長快等優(yōu)點，已成為目前我國沿海重要的海水養(yǎng)殖品種之一[3]。熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是生物體在環(huán)境因子刺激作用下發(fā)生熱休克反應(heat shock response, HSR)時啟動合成的一類蛋白。這類蛋白質通過修復、重折疊變性蛋白以及解離聚集的蛋白，最終達到對細胞和機體的保護作用[4]。而HSP70是熱休克蛋白家族的重要成員，它在進化上高度保守，作為主要的分子伴侶蛋白協(xié)助新生多肽的折疊、轉運以及變性蛋白的修復和重折疊等，而且它在細胞保護、抗凋亡以及免疫治療等方面有獨特復雜的生物學功能。

傳統(tǒng)的海洋污染物監(jiān)測方法主要是通過檢測水體和沉積物中污染物的形態(tài)和含量[5]，或是通過評價污染物對生態(tài)系統(tǒng)的宏觀影響來實現(xiàn)，并不能闡明生物體對這些脅迫作用的生理反應和機能變化。此外，低質量濃度的污染物可能在生態(tài)系統(tǒng)層面上沒有明顯變化，但卻能夠在生物的細胞或分子水平上有所反映，而這種變化依靠傳統(tǒng)的監(jiān)測手段并不易檢出。本研究以三疣梭子蟹為研究對象，通過急性和亞急性暴露實驗，通過半致死質量濃度和HSP70的相對表達量研究Cd2+對其肝胰腺和鰓的毒性效應，為建立基于三疣梭子蟹響應特征的典型海洋污染物檢測技術體系奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料及條件

試驗用三疣梭子蟹來自浙江寧波鑫億鮮活水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖場，平均體質量30.67±4.12 g，平均甲長4.15±0.51 cm，平均甲寬(全甲)8.32±1.34 cm。實驗容器為100 L的聚乙烯塑料水槽。實驗前在桶中暫養(yǎng)5 d，每天定時投喂新鮮的野雜魚，實驗前停食1 d。實驗用水為二級沙濾海水，pH為8.2±0.31，鹽度為23.3±2，水溫為23±1 ℃。CdCl2·25H2O(AR)用蒸餾水按Cd2+質量濃度配成10 mg/L的母液使用。

1.2方法

1.2.1急性毒性實驗

急性毒性實驗參照《魚類急性毒性試驗方法》[6]，在預試驗中，以10倍級差配制5個質量濃度組(0，0.1，1，10和100 mg/L)的CdCl2，對三疣梭子蟹處理24 h，得出Cd2+的100%致死質量濃度和0致死質量濃度。然后在此質量濃度范圍內設置了5個質量濃度梯度，分別為2，4，6，10和20 mg/L，每個質量濃度設置3個平行，每個平行組放15只蟹，并設置對照組，實驗持續(xù)96 h。試驗過程中隨時撈出死亡個體，觀察并記錄三疣梭子蟹中毒后的癥狀以及48，72和96 h死亡個體數(shù)。判斷死亡的標準是對外界刺激無反應，放入到自然海水中不能復活。

1.2.2Cd2+脅迫對三疣梭子蟹HSP70基因表達的影響

依據(jù)漁業(yè)水質標準(Cd2+<0.005 mg/L)和急性毒性實驗結果(SC=0.31 mg/L)，Cd2+質量濃度設置為3個質量濃度梯度和1個空白對照，分別為0，0.005，0.015和0.3 mg/L，每一梯度設3個平行，每個平行組放15只蟹，分別在2，4，8，12和24 h取2只蟹的鰓和肝胰腺，液氮保存。各組織在液氮中研磨后按Trizol法提取總RNA，在確認RNA完整后反轉成cDNA，反轉錄完成后于-20 ℃保存。

采用實時熒光定量PCR檢測三疣梭子蟹鰓和肝胰腺中HSP70基因的表達情況，HSP70基因和內參β-actin基因的PCR引物根據(jù)文獻[7]中的引物進行設計。HSP70引物為P1(5′-CCGTATCCCTAAGACCCAGAAA-3′)和P2(5′-CAGCCTCAGACTTATCA CCACAAA-3′)；β-actin引物為P3(5′-TCACACACTGTCCCCATCTACG-3′)和P4(5′-ACCACGCTCGGTCAGGATTTTC-3′)。采用Eppendorf Mastercycler ep realplex實時熒光定量PCR儀進行基因表達檢測，并設立空白對照。試驗所用體系為SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa公司)。反應體系為10 μL，即5 μL SYBR Green Master Mix Ⅱ，2 μL cDNA(100 ng/μL)模板，0.2 μL ROX Reference Dye(50×)，引物各0.4 μL(包括β-actin和HSP70)，2 μL ddH2O，同時設立空白對照組。PCR反應條件為：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;進行40個循環(huán)。反應結束后，按2-△△CT方法[8]進行結果計算。

1.3數(shù)據(jù)分析及公式

數(shù)據(jù)分析采用Excel和SPSS 13.0軟件，采用probit回歸求得48，72及96 h的半致死質量濃度(LC50)和相應時間下的95%置信區(qū)間，由公式:SC=96hLC50×0.1計算出安全質量濃度(SC)。采用單因素方差分析的Duncan多重比較法對轉錄組結果進行組間差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1急性毒性實驗結果

2.1.1三疣梭子蟹對Cd2+暴露的反應

三疣梭子蟹中毒后，會發(fā)生一系列變化。開始時表現(xiàn)為躁動不安，四處亂爬，逐漸頭胸甲顏色會發(fā)黃，活力逐漸下降，到最后變得僵硬。Cd2+的質量濃度越高癥狀越明顯，出現(xiàn)的時間越早。

2.1.2Cd2+對三疣梭子蟹的半致死質量濃度

Cd2+暴露后，除了對照組外，其余各組均出現(xiàn)死亡。并且死亡率隨著Cd2+質量濃度的增加與實驗時間的延長而提高，呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應和時間-效應關系。計算得到48 h的LD50為6.55 mg/L，95%置信區(qū)間為4.78～9.03 mg/L；72 h的LD50為4.33 mg/L，95%置信區(qū)間為3.05～5.91 mg/L；96 h的LD50為3.12 mg/L，95%置信區(qū)間為2.11～4.34 mg/L，SC為0.31 mg/L(表1)。

2.2Cd2+脅迫對三疣梭子蟹HSP70表達的影響

2.2.1Cd2+脅迫對三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表達的影響

Cd2+暴露后，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(圖1)，Cd2+質量濃度越高，這種趨勢越明顯，Cd2+質量濃度為安全質量濃度(SC=0.3 mg/L)時，HSP70在4 h表達量最高，為對照組的6倍，與其他各組均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，隨后持續(xù)下降，至24 h降至初始水平。Cd2+質量濃度為1/20SC(0.015 mg/L)時，HSP70的表達量在2～8 h顯著高于對照組(P<0.05)，在4 h達到峰值，高出對照組2倍。在漁業(yè)水質標準下(Cd2+質量濃度為0.005 mg/L)，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達量仍然表現(xiàn)為先上升后下降，在12 h達到最大值，此時表達量顯著高于對照組(P<0.05)，幾乎達到了安全質量濃度下的表達量(P>0.05)。

表1　Cd2+對三疣梭子蟹急性毒性實驗結果

圖1　不同暴露時間下三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表達量Fig.1　Transcription of HSP70 gene in hepatopancreas of P. trituberculatus after exposure of Cd2+

2.2.2Cd2+脅迫對三疣梭子蟹鰓中HSP70表達的影響

在Cd2+脅迫下，三疣梭子蟹鰓中HSP70的表達量變化趨勢與肝胰腺中相似，也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(圖2)。初始階段(2 h)，各質量濃度下HSP70的表達量與對照組均沒有顯著差異(P>0.05)。隨后各處理組的表達量均出現(xiàn)不同程度的增加，在4 h，安全質量濃度組(SC=0.3 mg/L)三疣梭子蟹鰓中HSP70的表達量遠高于對照組和漁業(yè)水質標準組(Cd2+質量濃度為0.005 mg/L)，與1/20SC組(0.015 mg/L)也存在顯著差異(P<0.05)。在8 h，除對照組外，其余各組HSP70的表達量均增加，且組間差異顯著(P<0.05)。12 h后進入下降階段，除了漁業(yè)水質組HSP70的表達量與對照組相似，其余兩組仍與對照組間存在顯著差異(P<0.05)。

圖2　不同暴露時間下三疣梭子蟹鰓中HSP70表達量Fig.2　Transcription of HSP70 gene in gill of P. trituberculatus after exposure of Cd2+

3討論

3.1Cd2+對三疣梭子蟹的半致死質量濃度和安全質量濃度

鎘是水遷移性元素，除了硫化鎘外，其他鎘的化合物均能溶于水，是《污水綜合排放標準》中的第一類污染物，在自然界中常以化合物狀態(tài)存在，一般含量很低，不會影響人體健康。當環(huán)境受到Cd2+污染后，Cd2+可在生物體內富集，通過食物鏈進入機體引起慢性中毒[9]。本研究結果表明，在高質量濃度Cd2+(2～20 mg/L)脅迫下，三疣梭子蟹的死亡率隨著Cd2+質量濃度的增大和時間的延長而遞增。呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應和時間-效應的關系。Cd2+對三疣梭子蟹48，72和96 h的半致死質量濃度分別為6.55，4.33和3.12 mg/L，理論安全質量濃度為0.31 mg/L。Cd2+對菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum48，72和96 h的半致死質量濃度分別為11.15，7.58和4.74 mg/L[10]，鯉魚Cyprinuscarpiocarpio幼魚Cd2+的96 h半致死質量濃度為2.51 mg/L[11]， Cd2+對可口革囊星蟲Phasolosmaesculenta的48和96 h半致死質量濃度分別為501和175 mg/L[12]。采用本文中的安全質量濃度算法，可以得出Cd2+對菲律賓蛤仔，鯉魚幼魚和可口革囊星蟲的理論安全質量濃度分別為0.47，0.25和17.5 mg/L，相比之下，三疣梭子蟹對Cd2+的耐受性介于雙殼類和魚類之間。一般在實驗和養(yǎng)殖水質管理中測得的Cd2+質量濃度比底泥中的要低[5]，三疣梭子蟹為底棲生物，在池塘養(yǎng)殖中接觸到的實際質量濃度可能會高于水中測定結果，因此。在制定三疣梭子蟹的養(yǎng)殖規(guī)范時，應將Cd2+質量濃度要求定得更低。

3.2Cd2+對三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表達的影響

HSPs廣泛存在于從原核生物到哺乳動物的整個生物界，是進化上高度保守、功能上至關重要的一類蛋白[13]。正常情況下，HSPs的表達量較少，主要起到分子伴侶的作用。在應激條件下，HSP能夠在細胞核和胞液之間轉運，修復錯誤折疊蛋白，加快正常蛋白質合成以實現(xiàn)細胞功能的恢復，同時增強機體的應激耐受性，提高細胞生存率[14]。因此，環(huán)境脅迫會引起生物體的應激蛋白(HSPs)表達水平的提高[15]。HSP家族中的HSP70因在受到環(huán)境刺激時表達量最多且對環(huán)境刺激敏感而在環(huán)境脅迫研究中受到廣泛關注。鎘暴露能引起野生貽貝消化道內HSP70的表達量呈直線上升[16]。氯化鎘誘導L929細胞株中HSP70的表達明顯增高[17]，草蝦Palaeomonetespugio受鎘脅迫后HSP70的表達顯著增加[18]。RAJESHKUMAR et al[19]發(fā)現(xiàn)受鎘污染的遮目魚Chanoschanos肝細胞內HSP70表達上升與水污染的程度有關。當甲殼動物受到脅迫時，肝胰腺是重金屬積累的主要場所，在毒理學研究中，甲殼動物的肝胰腺常被用作檢測的靶標器官[20]。因此，可以通過甲殼動物肝胰腺中HSP70的表達量來反應環(huán)境中Cd2+的污染情況。本研究中，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達量受到Cd2+的影響，隨時間變化先上升后下降，表現(xiàn)為倒“U”型趨勢，并且效應與Cd2+質量濃度呈現(xiàn)正相關，這與上述文獻中其他物種在Cd2+脅迫下HSP70表達增高的結論一致。在理論安全質量濃度(SC)時，HSP70表達量是對照組的6倍；在漁業(yè)水質標準要求質量濃度下，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達量仍然顯著高于對照組(P<0.05)，這說明低質量濃度的Cd2+仍能影響三疣梭子蟹肝胰腺HSP70基因的表達，因此，我們認為，漁業(yè)水質標準中Cd2+的允許質量濃度還需要降低。

3.3Cd2+對三疣梭子蟹鰓中HSP70表達的影響

重金屬在水生生物體內的積累與分布與不同組織的生理功能密切相關，鰓是三疣梭子蟹最重要的呼吸器官和滲透壓調節(jié)器官，也是外界污染物的早期靶點。盧敬讓 等[21]報道過鎘暴露導致中華絨螯蟹Eriocheirsinensis鰓組織和細胞結構的損傷。與肝胰腺相比鰓更早地接觸到鎘污染，鰓中含鈣較多，鈣元素和鎘元素化學性質相似，具有相同的電荷數(shù)和相近的離子直徑，鎘離子可替代鈣離子進入鰓中[22]。鰓中HSP70為了維持細胞內穩(wěn)態(tài)，緩解機體受到的應激損傷，在鰓中大量表達。本研究中，三疣梭子蟹鰓中HSP70的表達量隨時間呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在鎘脅迫下鰓中HSP70的表達量總體大于肝胰腺中，但對照組中HSP70表達量低于肝胰腺中，這可能是由于肝胰腺是三疣梭子蟹主要的解毒器官，在正常的代謝過程中會伴隨產(chǎn)生活性氧，活性氧過度積累會影響細胞的正常呼吸，HSP70可抑制產(chǎn)生氧自由基的關鍵酶即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，又能提高內源性過氧化酶如SOD水平，從而加快氧自由基的消除[23]。肝胰腺作為營養(yǎng)物質的代謝中心，需要較強的抗氧化系統(tǒng)清除肝胰腺中的多余活性氧。

4結論

本文通過Cd2+對三疣梭子蟹急性和亞急性暴露試驗分析，得出以下結論：

(1)Cd2+對三疣梭子蟹的毒性作用很強，在高質量濃度Cd2+脅迫下，呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應和時間-效應關系。Cd2+對三疣梭子蟹48，72和96 h的半致死質量濃度分別為6.55，4.33和3.12 mg/L，理論安全質量濃度為0.31 mg/L。

(2)在低質量濃度Cd2+脅迫下，利用高保守性分子HSP70檢測發(fā)現(xiàn)，在國家漁業(yè)水質標準(<0.005 mg/L)時，仍能引起三疣梭子蟹HSP70的顯著表達(P<0.05)。因此，從三疣梭子蟹養(yǎng)殖和食品安全的角度，漁業(yè)水質標準的Cd2+允許質量濃度需要進一步降低。

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Study on toxic effect of cadmium onPortunustrituberculatus

SONG Guo-lin, MU Chang-kao*, LI Rong-hua, WANG Chun-lin

(SchoolofMarineSciences,NingboUniversity,Ningbo315211,China)

Abstract:In this study, acute and sub-acute experiments were conducted to elucidate the toxic effect of cadmium on Portunus trituberculatus. The results show that the median lethal dose of cadmium are 6.55, 4.33 and 3.12 mg/L for 48 h，72 h and 96 h respectively, and the safe concentration of this metal is 0.31 mg/L. As the extension of exposure time, the expressions of HSP70 in hepatopancreas and gill are increased at the beginning, and then decreased significantly under the safe concentration and fishery water quality standard. Compared with control group, the expression of HSP70 in gill is more obvious than that in hepatopancreas. Under the safe concentration, the survival rate of Portunus trituberculatus is not changed obviously, but the excessive expression of HSP70 reflects that the crab is stressed by Cd(2+) exposure, so HSP70 indicators can be reflected more sensitive than the median lethal concentration at low concentration of Cd(2+ )pollution.

Key words:Portunus trituberculatus；Cd(2+)；acute toxicity test；HSP70

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008

中圖分類號:S917.4

文獻標識碼:A

文章編號:1001-909X(2016)01-0061-06

作者簡介:宋國林(1991-)，男，甘肅秦安縣人，主要從事水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖方面的研究。 E-mail：nbusgl@sina.cn*通訊作者:母昌考(1976-)，男，副教授，主要從事甲殼動物養(yǎng)殖方面的研究。E-mail：muchangkao@nbu.edu.cn

基金項目:寧波市重大科技攻關計劃項目資助(2013C11017)；浙江省公益性技術應用研究計劃資助(2011C33025)

收稿日期:2015-04-22修回日期:2015-10-11

宋國林，母昌考，李榮華，等. Cd2+對三疣梭子蟹的毒性效應研究[J]. 海洋學研究,2016,34(1):61-66, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008.

SONG Guo-lin, MU Chang-kao, LI Rong-hua，et al. Study on toxic effect of cadmium onPortunustrituberculatus[J]. Journal of Marine Sciences, 2016,34(1):61-66, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008.