唐仕軍，趙 冬，朱立倉(cāng)，李曉天，朱文學(xué)，楊 鵬，王業(yè)忠

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

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·論著·

氨基胍對(duì)氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元一氧化氮及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表達(dá)的影響研究

唐仕軍，趙 冬，朱立倉(cāng)，李曉天，朱文學(xué)，楊 鵬，王業(yè)忠

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

【摘要】目的探討氨基胍對(duì)氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元一氧化氮(NO)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)的影響。方法2014年11月—2015年7月選取新生24 h內(nèi)SD大鼠12只，分離及培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，取原代培養(yǎng)8 d的皮質(zhì)神經(jīng)元，分為3組：正常對(duì)照組、氧-糖剝奪組、氨基胍組。正常對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)元采用Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)，氧-糖剝奪組皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧、缺糖處理45 min后，換Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)；氨基胍組皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧、缺糖處理45 min后，換Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的同時(shí)加入終濃度為10 mmol/L的氨基胍溶液。各組培養(yǎng)2、6、12 h,采用硝酸還原法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO表達(dá)水平，采用Western blotting法檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果各組培養(yǎng)2、6、12 h時(shí)細(xì)胞上清液中NO、Caspase-3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中氧-糖剝奪組、氨基胍組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO、Caspase-3表達(dá)水平較正常對(duì)照組升高(P<0.05)；氨基胍組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO、Caspase-3表達(dá)水平較氧-糖剝奪組降低(P<0.05)。結(jié)論氨基胍可抑制氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NO及神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)水平，從而抑制皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡,對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)元；一氧化氮；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；氨基胍

唐仕軍，趙冬，朱立倉(cāng)，等.氨基胍對(duì)氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元一氧化氮及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表達(dá)的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(12)：1429-1434.[www.chinagp.net]

Tang SJ,Zhao D,Zhu LC,et al.Effect of aminoguanidine on the expression of NO and Caspase-3 in rat cortical neurons after oygen glucose deprivation[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1429-1434.

缺血性腦血管病是由于各種原因?qū)е虏糠帜X組織的血流減少或中斷，引起神經(jīng)元功能障礙和結(jié)構(gòu)損害的一組疾病?！吨袊?guó)腦卒中防治報(bào)告(2015)》[1]顯示,腦卒中已經(jīng)成為我國(guó)人口死亡和致殘的第一原因，腦卒中具有高發(fā)病率、高病死率和高致殘率，給我國(guó)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。如何預(yù)防和治療腦血管病，尋求一種合適的藥物減輕腦損傷，一直是全社會(huì)共同關(guān)注的問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，缺血、缺氧可誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生一氧化氮(NO)，過(guò)量的NO與腦損傷有關(guān)[2]。在體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元中，氧-糖剝奪可導(dǎo)致皮質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生過(guò)量NO，并造成神經(jīng)元的損傷，缺氧、缺糖環(huán)境下所產(chǎn)生的NO在神經(jīng)元凋亡中可能發(fā)揮著重要作用[3]。因此，本研究以體外原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用氨基胍對(duì)氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)，觀察培養(yǎng)液中NO表達(dá)水平與神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)水平的時(shí)相變化，探討氨基胍在氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物2014年11月—2015年7月選取新生24 h內(nèi)SD大鼠12只，其中雄性8只，雌性4只；體質(zhì)量35～50 g；購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2儀器二氧化碳(CO2)細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma)，Thermo超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo Electron Corporation)，缺氧培養(yǎng)箱(浙江省新安江分析儀器二廠)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus)，半干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)液(HyClone公司)，胎牛血清(杭州四季青集團(tuán)公司)，DMEM無(wú)糖培養(yǎng)液、Neurobasal培養(yǎng)液、2%B27培養(yǎng)液添加劑、0.25%胰酶、氨基胍、青霉素和鏈霉素(10 000 U/ml)、L-谷氨酰胺(GIBCO公司)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體、Caspase-3抗體(Abcam 公司)，L-多聚賴氨酸(PDL)、磷酸鹽緩沖液(PBS)〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)。接種培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗(青霉素和鏈霉素，100 U/ml)；無(wú)血清培養(yǎng)液：Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑+0.5 mmol/L L-谷氨酰胺+雙抗(青霉素和鏈霉素，100 U/ml)；L-多聚賴氨酸溶液(PLL，1 mg/ml)：25 mg PDL溶于250 ml PBS中，0.22 μm濾器濾菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分離及培養(yǎng)在文獻(xiàn)[4]基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)，取出生24 h內(nèi)的新生乳鼠12只，在盛有75%乙醇溶液的燒杯中清洗2次，1 min/次，在超凈臺(tái)下迅速斷頭取腦，置入預(yù)冷的玻璃皿中。在體視顯微鏡下小心剝離皮質(zhì)表面的腦膜和血管，換用另一把眼科鑷小心夾取額部一薄層皮質(zhì)組織，置于盛有1 ml DMEM高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于冰上。用眼科剪將皮質(zhì)組織剪成約1 mm×1 mm碎塊，加入0.25%胰酶，使其終濃度為0.125%，充分混勻胰酶，在37 ℃CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中消化15 min，5 min時(shí)輕輕搖晃培養(yǎng)皿，15 min時(shí)加入等量接種培養(yǎng)基終止消化。用1 ml進(jìn)口槍頭輕輕吹打細(xì)胞，將吹打后的細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min(離心半徑13.5 cm)，棄上清液，加入2 ml接種培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以≥1×106/ml接種到提前經(jīng)PLL包被的6孔板中，使每孔有2 ml接種培養(yǎng)基，沿前后、左右、左上左下、右上右下方向充分混勻細(xì)胞，置于37 ℃ CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后用無(wú)血清培養(yǎng)液全量換液1次，以后每3 d半量換液。

1.4.2皮質(zhì)神經(jīng)元的鑒定培養(yǎng)8 d的皮質(zhì)神經(jīng)元，以抗NSE多克隆抗體作為一抗，采用免疫熒光雙重染色方法鑒定皮質(zhì)神經(jīng)元：(1)用0.01%預(yù)冷的PBS浸洗細(xì)胞爬片2次，吸盡PBS，4%多聚甲醛溶液固定5 min，PBS浸洗2次，5 min/次；(2)3%H2O2溶液封閉30 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；(3)PBS浸洗3次，5 min/次；(4)山羊血清封閉30 min；(未浸洗)加入一抗(NSE,1∶500)，4 ℃冰箱孵育隔夜(約12 h)；(5)PBS浸洗3次，5 min/次，加入二抗；(6)避光孵育60 min后PBS浸洗3次，5 min/次；(7)滴加碘化丙啶(PI)染液(1∶1 000稀釋)100 μl，30 s后用PBS浸洗2次，2 min/次；(8)甘油(約30 ml)封固，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3實(shí)驗(yàn)分組分為3組：正常對(duì)照組、氧-糖剝奪組、氨基胍組。正常對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)元采用Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)；氧-糖剝奪組皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧、缺糖處理45 min后，換Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)；氨基胍組皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧、缺糖處理45 min后，換Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的同時(shí)加入終濃度為10 mmol/L氨基胍溶液。

1.4.4氧-糖剝奪模型的建立參照文獻(xiàn)[5-6]，培養(yǎng)8 d的皮質(zhì)神經(jīng)元，吸盡培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗3次，換用DMEM無(wú)糖培養(yǎng)液造成缺糖環(huán)境，在細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃，充滿95%N2和5%CO2)中培養(yǎng)45 min，換Neurobasal培養(yǎng)液+2%B27培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)，在37 ℃ CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4.5NO表達(dá)水平測(cè)定分別在培養(yǎng)2、6、12 h時(shí)留取各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，置于-80 ℃凍存，采用硝酸還原酶法測(cè)定各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO表達(dá)水平，按照試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。

1.4.6Western blotting法檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取50 μg總蛋白上樣行10%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBS洗滌6次，5 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG抗體1∶20 000)室溫孵育2 h。再用TBS洗滌6次，5 min/次，加入化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色。以β-actin為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，目的條帶為32 Ku。采用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察皮質(zhì)神經(jīng)元接種時(shí)形態(tài)小，透亮，呈圓形，單個(gè)散在分布(見圖1A，本文圖1、2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。皮質(zhì)神經(jīng)元接種后有少量皮質(zhì)神經(jīng)元開始貼壁，2h左右皮質(zhì)神經(jīng)元貼壁較多，少量皮質(zhì)神經(jīng)元伸出短小的突起，4h左右皮質(zhì)神經(jīng)元已基本貼壁，大量皮質(zhì)神經(jīng)元伸出突起，周圍光暈明顯。3d時(shí)皮質(zhì)神經(jīng)元突起明顯伸長(zhǎng)，相互交織，皮質(zhì)神經(jīng)元透亮，立體感強(qiáng)，呈圓形、橢圓形、梭形(見圖1B)。5～6d時(shí)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞體增大，突起交織成網(wǎng)狀(見圖1C)。7～8d時(shí)，皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞體飽滿，細(xì)胞質(zhì)透亮，細(xì)胞核大而明顯，細(xì)胞體周圍折光性強(qiáng)，立體感好，突起交織成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖1D)。

2.2免疫熒光雙重染色法鑒定皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)8d的皮質(zhì)神經(jīng)元，經(jīng)NSE和PI染液免疫熒光雙標(biāo)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，激光共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)和軸突被染成綠色且細(xì)胞核被染成紅色的為皮質(zhì)神經(jīng)元，細(xì)胞核被染成紅色而細(xì)胞質(zhì)無(wú)染色的為非皮質(zhì)神經(jīng)元。經(jīng)鑒定此分離培養(yǎng)的是皮質(zhì)神經(jīng)元，且純度高、密度大，皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核染色清晰，形態(tài)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，陽(yáng)性率為(93.5±2.3)%(見圖2)。

2.3各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO表達(dá)水平比較各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中氧-糖剝奪組、氨基胍組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO表達(dá)水平較正常對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氨基胍組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中NO表達(dá)水平較氧-糖剝奪組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4各組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)水平比較各組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中氧-糖剝奪組、氨基胍組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)水平較正常對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氨基胍組不同時(shí)間點(diǎn)，Caspase-3表達(dá)水平較氧-糖剝奪組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖3)。

注：A為接種1 d,B為接種3 d,C為接種5～6 d,D為接種7～8 d

圖1倒置相差顯微鏡下不同時(shí)期皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)觀察(×200)

Figure 1Morphological changes of rat cortical neurons at different time points under inverted phase contrast microscope

注：A為綠光下NSE對(duì)神經(jīng)元染色；B為白光下神經(jīng)元形態(tài)；C為PI染液對(duì)細(xì)胞核染色；D為混合光下神經(jīng)元染色

圖2免疫熒光雙重染色法鑒定皮質(zhì)神經(jīng)元(×400)

Figure 2Identification of cortical neurons by immunofluorescence double staining method

注：Caspase-3=半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

圖3Western blotting法檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平

Figure 3Caspase-3 expression detected by Western blotting method

Table1ComparisonofNOexpressionincellsupernatantatdifferenttimepointsamongthethreegroups

組別2h6h12h正常對(duì)照組4.22±0.504.22±0.504.22±0.50氧-糖剝奪組8.67±0.49a11.11±0.79a17.31±0.61a氨基胍組6.89±0.10ab8.89±0.79ab14.44±0.79abF值108.711136.709630.960P值<0.001<0.001<0.001

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與氧-糖剝奪組比較，bP<0.05

Table2ComparisonofCaspase-3expressionatdifferenttimepointsamongthethreegroups

組別2h6h12h正常對(duì)照組0.20±0.010.20±0.010.20±0.01氧-糖剝奪組0.46±0.04a0.53±0.04a0.70±0.01a氨基胍組0.39±0.01ab0.46±0.01ab0.55±0.02abF值117.185216.266588.428P值<0.001<0.001<0.001

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與氧-糖剝奪組比較，bP<0.05

3討論

研究表明，NO在缺血性腦損傷中存在雙重作用，與組織損傷發(fā)展進(jìn)程和產(chǎn)生的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的類型有關(guān)，根據(jù)其來(lái)源不同，既表現(xiàn)為對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用，又表現(xiàn)為對(duì)神經(jīng)的毒性作用[7-8]，生理劑量的NO可以降低血管張力、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集和黏附、降低白細(xì)胞黏附和遷移等，大劑量的NO可與超氧陰離O2-結(jié)合形成具有極強(qiáng)細(xì)胞毒性的ONOO-[9]。NOS是體內(nèi)合成NO的關(guān)鍵和唯一的限速酶，有3種類型：神經(jīng)源型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)[10]，在腦缺血早期因eNOS激活產(chǎn)生的NO可通過(guò)鳥氨酸環(huán)化酶使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平升高，擴(kuò)張腦血管，從而增加缺血區(qū)腦血流量，對(duì)抗凋亡，保護(hù)腦組織，而由nNOS及iNOS激活產(chǎn)生的NO激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)通向細(xì)胞死亡的最后通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。iNOS被激活后催化合成大量的NO，高濃度的NO可以與超氧陰離子反應(yīng)生成超氧亞硝酸陰離子，并進(jìn)一步分解為OH和NO2等自由基，可對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性，最終引起細(xì)胞死亡[12]。在氧-糖剝奪20 min離體腦片模型中，iNOS的活性在缺血損傷后2 h開始出現(xiàn)。如僅剝奪10 min，iNOS的活性在缺血損傷后3 h開始出現(xiàn)，在210 min達(dá)到高峰[13]。因此，在腦缺血缺氧早期，iNOS活性的激活以及產(chǎn)生的過(guò)量NO對(duì)神經(jīng)的毒性作用是缺血缺氧對(duì)腦組織損傷的重要因素。

細(xì)胞凋亡即程序化細(xì)胞死亡，是細(xì)胞的一種自殺方式，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有3種:死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、線粒體通路[14-15]。這3種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均不可逆，且均與Caspase有關(guān)，而在Caspase家族中，Caspase-3是所有凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最為關(guān)鍵的終末凋亡執(zhí)行蛋白[16-17]，因此通過(guò)測(cè)定Caspase-3的表達(dá)水平可間接反映細(xì)胞的凋亡。

氨基胍是一種iNOS特異性抑制劑，其對(duì)iNOS的抑制能力比NG-甲基-L-精氨酸(L-NAME)更有效[18]，其抑制作用是L-NAME的7倍[19]，氨基胍通過(guò)抑制iNOS 的活性，可減少NO 水平，降低NO 的毒性損傷作用[20]。實(shí)驗(yàn)研究提示，氨基胍對(duì)缺氧、缺糖損傷體外培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮神經(jīng)元具有保護(hù)作用[21]，氨基胍可以改善糖尿病視網(wǎng)膜病變，且作用途徑與選擇性iNOS有關(guān)[22]。氨基胍抑制iNOS的機(jī)制可能是：(1)與催化部位的血紅素鐵結(jié)合，從而改變活性集團(tuán)的構(gòu)象。(2)Bryk等[23]研究發(fā)現(xiàn)，氨基胍通過(guò)在活性位點(diǎn)上與血紅素殘基共價(jià)結(jié)合，并將被修飾的亞鐵血紅素殘基以共價(jià)鍵形式結(jié)合于蛋白的活性位點(diǎn)，從而對(duì)iNOS起明顯的抑制作用。(3)氨基胍可產(chǎn)生大量的自殺性產(chǎn)物來(lái)抑制iNOS的產(chǎn)生。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于氨基胍的神經(jīng)元保護(hù)作用研究主要集中于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中很少。因此，本文以體外原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)氧-糖剝奪后給予氨基胍進(jìn)行干預(yù)，觀察不同時(shí)間點(diǎn)NO表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡因子Caspase-3表達(dá)水平的變化，從而探討氨基胍在皮質(zhì)神經(jīng)元損傷中的作用。

本研究結(jié)果顯示，在2、6、12 h氧-糖剝奪組皮質(zhì)神經(jīng)元NO表達(dá)水平均較正常對(duì)照組升高；氨基胍組皮質(zhì)神經(jīng)元各時(shí)間點(diǎn)NO表達(dá)水平均較氧-糖剝奪組降低。提示，缺氧、缺糖引起了皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷，使NO過(guò)度表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NO表達(dá)水平逐漸增加，皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷逐漸加重；氨基胍干預(yù)后，NO表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均明顯降低，說(shuō)明皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷有所減輕。本研究證實(shí)，氨基胍可以減少皮質(zhì)神經(jīng)元損傷后NO的過(guò)度表達(dá)，從而減輕皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷，對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，這與Cash等[24]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，在2、6、12 h氧-糖剝奪組皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)水平均較正常對(duì)照組升高，氨基胍干預(yù)后，各時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)水平較氧-糖剝奪組均降低。提示，缺氧、缺糖引起了神經(jīng)元的凋亡，經(jīng)氨基胍干預(yù)后，Caspase-3表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均明顯降低，說(shuō)明皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡有所減輕。本研究證實(shí)，氨基胍可抑制凋亡相關(guān)因子Caspase-3 的表達(dá)水平，從而抑制缺氧、缺糖后皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡，對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用,與Sun等[25]研究結(jié)果一致。其機(jī)制可能是：皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧、缺糖損傷后，iNOS被激活，產(chǎn)生了大量的NO，激活了Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)凋亡途徑，致Caspase-3表達(dá)水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生凋亡。給予氨基胍干預(yù)后，氨基胍能選擇性抑制iNOS的活性，從而減少NO過(guò)度表達(dá)，降低了NO對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的毒性損傷作用，從而抑制了凋亡因子Caspase-3表達(dá)，進(jìn)而減少了細(xì)胞凋亡，起到了保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元的作用。

綜上所述，氨基胍可抑制氧-糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NO及凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)，從而抑制皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡,對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。氨基胍可減輕氧-糖剝奪引起的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能是氨基胍通過(guò)選擇性抑制iNOS活性的表達(dá)，減少NO過(guò)度表達(dá)，從而抑制了凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)仍處于基礎(chǔ)研究階段，仍需在今后對(duì)氨基胍最佳藥物濃度、潛在的藥物不良反應(yīng)、其他藥物干預(yù)及其抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制等問(wèn)題進(jìn)行深入研究。

作者貢獻(xiàn)：唐仕軍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；趙冬、朱立倉(cāng)、李曉天、朱文學(xué)、楊鵬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；王業(yè)忠進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of Aminoguanidine on the Expression of NO and Caspase-3 in Rat Cortical Neurons After Oygen Glucose Deprivation

TANGShi-jun,ZHAODong,ZHULi-cang,etal.DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of aminoguanidine on the expression of nitric oxide (NO) and Caspase-3 in rat cortical neurons after oxygen and glucose deprivation.MethodsFrom December 2014 to July 2015,12 SD rats born within 24 hours were selected.The cortical neurons of the rats were separated and cultured,and cortical neurons of primary culture for 8 days were obtained and were divided into three groups:normal control group,oxygen-glucose deprivation group and aminoguanidine group.The cortical neurons of normal control group were cultured by Neurobasal+2%B27 nutrient solution;the cortical neurons of oxygen-glucose deprivation group received 45 min management for hypoxia and lack of sugar,and converted to be cultured by Neurobasal+2%B27 nutrient solution;the cortical neurons of aminoguanidine group received 45 min management for hypoxia and lack of sugar,and converted to be cultured by Neurobasal+2%B27 nutrient solution plus 10 mmol/L aminoguanidine solution.After culture for 2,6 and 12 h,the NO expression in cell supernatant was detected using nitric oxide assay kit,and Caspase-3 expression was detected using Western blotting method.ResultsThe three groups were significantly different in the expression levels of NO in cell supernatant and Caspase-3 at 2,6 and 12 h(P<0.05).Oxygen-glucose deprivation group and aminoguanidine group were higher than normal control group in the expression levels of NO in cell supernatant and Caspase-3 at different time points(P<0.05).Aminoguanidine group was lower than oxygen-glucose deprivation group in the expression levels of NO in cell supernatant and Caspase-3 at different time points(P<0.05).ConclusionAminoguanidine can inhibit the expression of NO and apoptosis related gene Caspase-3 in the rat cortical neurons after oxygen and glucose deprivation,which inhibits the apoptosis of cortical neurons and has a protective effect on the neurons.

【Key words】Neurons；Nitric oxide；Caspase-3；Aminoguanidine

(收稿日期：2015-08-26；修回日期：2016-02-22)

【中圖分類號(hào)】R 743.33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.015

通信作者：王業(yè)忠，832000 新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；E-mail：wangyz2008@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)資金資助項(xiàng)目(81360185)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士基金資助項(xiàng)目(2011BB016)