胡基華　陳靜宇　　　曹旭　孟力強(qiáng)　姜威　劉宇帥　張淑梅　李晶

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱，150010)　　　　　　　　　　　　(黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院)

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高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的粘質(zhì)沙雷氏菌株的誘變選育1)

胡基華陳靜宇曹旭孟力強(qiáng)姜威劉宇帥張淑梅李晶

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱，150010)(黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院)

摘要以黑龍江省科學(xué)院微生物研究所實(shí)驗(yàn)室保存的1株粘質(zhì)沙雷氏菌S68為出發(fā)菌株，進(jìn)行原生質(zhì)體紫外線、NaNO2和復(fù)合誘變，通過(guò)透明圈對(duì)比和酶活測(cè)定，最終獲得1株產(chǎn)酶量高于原始菌株4.3倍的粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株，產(chǎn)酶量達(dá)到4.98 μg·h(-1)。確定該菌株最佳誘變方法為復(fù)合誘變，首先進(jìn)行紫外誘變(高度為30 cm，誘變時(shí)間為12 s)，再用化學(xué)誘變(0.4 mol·L(-1)NaNO2誘變5 min)，經(jīng)驗(yàn)證該誘變菌株遺傳穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞粘質(zhì)沙雷氏菌；幾丁質(zhì)酶；誘變

分類號(hào)Q93-31

High Chitinase ofSerratiamarcescensStrain Mutation

Hu Jihua, Chen Jingyu

(Institute of Microbiology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150020, P. R. China); Cao Xu, Meng Liqiang, Jiang Wei, Liu Yushuai, Zhang Shumei, Li Jing(Institute of Advanced Technology, Heilongjiang Academy of Science)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：106-109.

WithSerratiamarcescensS68 in the Heilongjiang Academy of Sciences Institute of Microbiology Laboratory, we obtained an enzyme production 4.3 times higher than the original strain ofS.marcescensmutant strain by using protoplast ultraviolet, NaNO2and composite mutagenesis, with the enzyme production of 4.98 μg·h-1. We determined that the best methods of mutagenesis of the strain was the composite mutagenesis by first UV mutation (height of 30 cm, for mutagenesis time of 12 s), and then the chemical mutagenesis (0.4 mol·L-1NaNO2mutagenesis for 5 min).

KeywordsSerratia marcescens; Chitinase; Mutation

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)亦稱靈桿菌，是革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，屬于腸桿菌科克白雷氏菌族中的沙雷氏菌屬，為該屬的代表菌種，多存在于沿海鹽堿土壤中，能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶[1]。

幾丁質(zhì)酶具有多種生理功能，應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。自Benecke首次報(bào)道了枯草芽孢桿菌(Bacilluschitinovorus)能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶以來(lái)，又發(fā)現(xiàn)了許多產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物種類，包括細(xì)菌、放線菌和真菌等。其中對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌、褶皺鏈霉菌普安變種(Streptomycesplicatusvar.puanensis)及創(chuàng)傷貝內(nèi)克氏菌(Vibriovulnificus)[2-4]的研究較多。1986年Schlumbaum et al.[5]首次報(bào)道了提純的菜豆幾丁質(zhì)酶具有抗真菌活性。接下來(lái)的研究[6]發(fā)現(xiàn)，提純的煙草、馬鈴薯、黃瓜等多種植物幾丁質(zhì)酶對(duì)立枯絲核菌等20多種病原真菌和非病原真菌的菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)具有抑制作用。Minic et al.[7]研究表明，幾丁質(zhì)酶可以參與共生固氮調(diào)控；Stangarlin et al.[8]的研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶參與植物光合作用等過(guò)程。幾丁質(zhì)酶制劑可以阻礙有害生物幾丁質(zhì)的正常合成，是一類長(zhǎng)效的、具有選擇性的殺蟲劑或殺菌劑，在農(nóng)藥生產(chǎn)中有較高應(yīng)用價(jià)值[9]。目前應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)菌株幾乎毫無(wú)例外都是經(jīng)過(guò)誘變育種、化學(xué)誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)或基因工程等方法對(duì)菌種進(jìn)行改造而獲得的，其中最為突出的例子就是青霉素生產(chǎn)菌種的選育。目前微生物幾丁質(zhì)酶的研究與應(yīng)用取得了一些成就，但與實(shí)際需要還有一些差距，主要表現(xiàn)在篩選的菌株產(chǎn)酶量低，且酶活不穩(wěn)定。

為了獲得產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力高的菌株，對(duì)黑龍江省科學(xué)院微生物研究所實(shí)驗(yàn)室分離并保存的1株粘質(zhì)沙雷氏菌S68進(jìn)行紫外、NaNO2單因素和復(fù)合誘變，通過(guò)平板幾丁質(zhì)透明圈初篩、酶活測(cè)試和搖瓶復(fù)篩，篩選出1株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的誘變株，并對(duì)該菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。

1材料與方法

1.1材料

菌種為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所實(shí)驗(yàn)室保存的粘質(zhì)沙雷氏菌種S68。

完全培養(yǎng)基的配比為葡萄糖5.00 g·L-1、牛肉膏1.50 g、蛋白胨5.00 g·L-1、酵母膏3.00 g·L-1、NaCl 3.50 g·L-1、K2HPO43.65 g·L-1、KH2PO41.32 g·L-1。在完全培養(yǎng)基中添加0.50 mol·L-1蔗糖、0.02 mol·L-1順丁烯二酸、0.5%酪素即為高滲培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1菌種培養(yǎng)

取粘質(zhì)沙雷氏菌斜面保存的菌種1環(huán)，接入5 mL試管中，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)16 h；將試管中培養(yǎng)好的菌液以2%接種量接入到裝液量30 mL的250 mL的三角瓶中，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)16 h。

1.2.2原生質(zhì)體制備

取發(fā)酵18 h的菌液10 mL，16 000 r·min-1離心15 min，菌體用0.01 mol·L-1Tris緩沖液(pH=7.0)離心洗滌3次。再用高滲Tris緩沖液懸浮，加入預(yù)熱的溶菌酶溶液，37 ℃水浴處理后，加入EDTA至0.01 mol·L-1，在37 ℃中保溫。

1.2.3紫外誘變

取10 mL 1.2.2方法制備得到的原生質(zhì)體高滲懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，放在磁力攪拌器上，在距紫外燈30 cm處攪拌狀態(tài)下照射12 s，取照射后的細(xì)胞懸液，在黑暗中用SMM緩沖液稀釋至原濃度的10-6倍，涂布作為對(duì)照。將上述平板做避光處理，置于培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算出致死率。

1.2.4NaNO2誘變

依次取搖瓶培養(yǎng)16 h的菌懸液5 mL，加入2 mL 0.10 mol·L-1的NaNO2，分別作用5、10、15 min后，加入2 mL 0.7 mol·L-1的NaHPO4終止反應(yīng)[10]。以相同處理方法分別再用0.2、0.4 mol·L-1的NaNO2誘變菌懸液各5、10、15 min。將上述處理及對(duì)照分別用生理鹽水稀釋至原濃度的10-6倍后涂布初篩平板，置于培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

1.2.5復(fù)合誘變

將經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體紫外線誘變后的菌懸液再經(jīng)NaNO2誘變處理，將上述處理及對(duì)照分別稀釋至原濃度的10-6倍后涂布初篩平板，依次標(biāo)記為UN和NU后，置于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

1.2.6粘質(zhì)沙雷氏菌S68生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以1%的接種量接種裝有5 mL培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)接到裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，150 r·min-1連續(xù)培養(yǎng)72 h，每隔4 h取樣，600 nm測(cè)生物量，制粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7酶活測(cè)定

N-乙酰葡萄糖胺(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置質(zhì)量濃度12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0 g·L-1的N-乙酰葡萄糖胺溶液，測(cè)定其在585 nm條件下的光吸收值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

粘質(zhì)沙雷氏菌S68酶活：配制培養(yǎng)基500 mL，分裝到10個(gè)250 mL的三角瓶中，每瓶45 mL培養(yǎng)基加入5 mL幾丁質(zhì)，1%接種量接入誘變菌株，培養(yǎng)條件與測(cè)生長(zhǎng)曲線相同，分別在36、38、40、42、44 h各取2瓶，分別使用體積分?jǐn)?shù)為35%和75%的硫酸銨逐級(jí)沉淀蛋白提取粗酶(每個(gè)梯度24 h)，除鹽濃縮后，取0.4 mL樣品，0.4 mL蒸餾水為空白對(duì)照，分別加入0.4 mL的0.05 mol·L-1醋酸液，0.4 mL的膠體幾丁質(zhì)(1%)，37 ℃水浴(2 h)，降解幾丁質(zhì)成單糖；離心(4 000 r·min-1、4 ℃、10 min)取0.4 mL上清液加入40 μL 1%蝸牛酶水浴(37 ℃，30 min)，加入0.2 mL飽和硼砂緩沖；干式恒溫器100 ℃，7 min，冷卻后再加入2 mL冰醋酸和1 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的DMAB水浴(37 ℃，15 min)進(jìn)行顯色反應(yīng)，585 nm測(cè)吸光度，酶活力單位(U)表示在上述反應(yīng)條件下，每1 min時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生1 μmol NAG所需要的酶量。

圖1　N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(OD585nm)

2結(jié)果與分析

2.1粘質(zhì)沙雷氏菌S68 NaNO2誘變

通過(guò)對(duì)生物量的測(cè)量，圖2顯示，粘質(zhì)沙雷氏菌S68生長(zhǎng)較快，12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h菌體處于穩(wěn)定期，本研究取生長(zhǎng)16 h的菌液做化學(xué)、紫外和復(fù)合誘變。

圖2　粘質(zhì)沙雷氏菌S68菌株的生長(zhǎng)曲線

NaNO2不同作用濃度，不同作用時(shí)間對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌懸液的誘變效果(致死率)見(jiàn)圖3。相同時(shí)間條件下，濃度高的致死率高。在同一濃度下，致死率隨著時(shí)間延長(zhǎng)，0.10 mol·L-1處理在5、10、15、20 min的死亡率分別為20%、51%、82%、98%，在第25分鐘時(shí)死亡率為100%；0.2 mol·L-1處理在5、10、15 min死亡率分別為41%、59%、82%，在第20分鐘時(shí)死亡率為100%；0.4 mol·L-1處理在5、10、15 min死亡率分別為68%、84%、94%，在第20分鐘時(shí)死亡率為100%；根據(jù)致死率選擇0.1、0.2、0.4 mol·L-13個(gè)濃度，誘變時(shí)間選擇5、10、15 min，進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)。

圖3　化學(xué)誘變的致死曲線

通過(guò)NaNO2誘變共得到52株酶圈大于空白對(duì)照的菌株，表1顯示HC值較大的5株菌，編號(hào)為M1～M5，比值按從大到小進(jìn)行排列。結(jié)果顯示經(jīng)NaNO2誘變后，菌落直徑和透明圈直徑都有不同程度的縮小，但是HC值要大于空白對(duì)照，其中誘變株M1相比出發(fā)菌株CK的HC值提高了21.9%。

表1　化學(xué)誘變菌圈直徑

2.2粘質(zhì)沙雷氏菌S68紫外誘變

紫外線不同照射時(shí)間，不同照射高度作用于粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體的致死曲線見(jiàn)圖4。隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，照射源與菌液之間距離越近，致死率越高。在20 cm高度，照射5、10、15、20 min的死亡率分別為38%、68%、83%、99%，在第25分鐘時(shí)死亡率為100%；在30 cm高度，照射5、10、15 min的死亡率分別為51%、78%、91%，在第20分鐘時(shí)死亡率為

100%；在40 cm高度，照射5、10、15 min的死亡率分別為75%、89%、95%，在第20分鐘時(shí)死亡率為100%；本研究選擇照射高度在30 cm高度，作用時(shí)間為10～12 s進(jìn)行試驗(yàn)。

通過(guò)紫外誘變共獲得48株HC值大于空白對(duì)照的菌株，挑選最大的5株列于表2，編號(hào)為UM1～UM5。由表2可以看出，經(jīng)原生質(zhì)體紫外線誘變后，各誘變株的菌落直徑差異不明顯，菌落直徑和透明圈直徑都有不同程度的縮小，其中UM1比空白對(duì)照CK提高了6%。

圖4　原生質(zhì)體紫外誘變的致死曲線

菌株編號(hào)誘變方法菌落直徑/cm透明圈直徑/cmHC值UM1高度30cm誘變15s1.281.701.375UM2高度30cm誘變12s0.720.961.333UM3高度30cm誘變12s1.301.701.328UM4高度30cm誘變10s1.201.651.308UM5高度30cm誘變12s1.181.541.305CK野生菌株1.301.681.292

2.3粘質(zhì)沙雷氏菌S68復(fù)合誘變

將經(jīng)原生質(zhì)體紫外線誘變得到的菌株再用NaNO2進(jìn)行誘變后，挑取HC值相對(duì)較大的10株菌依次編號(hào)為CM1～CM10(表3)。由表3可以看出，對(duì)比2種不同的單因素誘變技術(shù)，復(fù)合誘變方法對(duì)該菌株具有更好的誘變效果，菌落直徑和透明圈直徑都未減小，CM5號(hào)菌株HC值比出發(fā)菌株CK提高了40.7%。

表3　不同復(fù)合誘變處理下菌株透明圈的篩選和酶活性

圖5顯示復(fù)合誘變株在60 h后產(chǎn)生透明酶圈。在培養(yǎng)64 h后，CM5菌株酶活值為4.98 μg·h-1，與原始菌株相比酶活提高了4.3倍(表3)。

圖5　復(fù)合誘變平板初篩結(jié)果

2.4誘變菌株CM5遺傳穩(wěn)定性

將誘變菌株CM5培養(yǎng)10代，測(cè)定第2、4、6、8、10代酶活(表4)，結(jié)果顯示產(chǎn)酶均比較穩(wěn)定，說(shuō)明復(fù)合誘變方法在提高出發(fā)菌株幾丁質(zhì)酶活力的同時(shí)并具有遺傳穩(wěn)定性。

表4　誘變菌株CM5傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)

3結(jié)論與討論

以黑龍江省科學(xué)院微生物研究所實(shí)驗(yàn)室保存的1株粘質(zhì)沙雷氏菌S68為出發(fā)菌株，利用NaNO2、紫外和復(fù)合誘變3種方法篩選出1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活高的菌株CM5。確定其最佳誘變方法為復(fù)合誘變：在紫外誘變(高度為30 cm，誘變時(shí)間為12 s)后，再用化學(xué)誘變(0.4 mol·L-1NaNO2誘變5 min)。在單因素誘變?cè)囼?yàn)中，化學(xué)誘變的效果好于紫外誘變。影響NaNO2誘變的主要因素是濃度，在相同時(shí)間條件下，隨著濃度的提高，致死率也提高；在0.1、0.2 mol·L-1時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，誘變對(duì)菌株致死率不明顯。在對(duì)紅色素產(chǎn)生菌RZ21的原生質(zhì)體紫外誘變育種研究中也有類似現(xiàn)象[11]，推測(cè)是由于NaNO2引起DNA鏈堿基之間的互換，使其在自我復(fù)制時(shí)產(chǎn)生DNA鏈分子突變，因此誘變效果隨NaNO2作用時(shí)間延長(zhǎng)而未見(jiàn)明顯提高[12]。紫外誘變?cè)囼?yàn)中，誘變時(shí)間固定時(shí)，菌液離照射源越近致死率越高，而在距離一定時(shí)，菌液隨著時(shí)間加長(zhǎng)致死率升高。

近年來(lái)，隨著幾丁質(zhì)衍生物的研究和開(kāi)發(fā)，其在醫(yī)藥、食品和環(huán)保等眾多領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景，微生物幾丁質(zhì)酶在害蟲防治中具有增效作用，可以作為物理屏障阻礙寄生物入侵，海洋中也積聚有豐富的幾丁質(zhì)[13]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因水平的育種方法日趨成為主流，但傳統(tǒng)的物理與化學(xué)誘變方法作為生物學(xué)誘變方法的基礎(chǔ)，在某些領(lǐng)域以及基因育種的輔助手段依然具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

筆者接下來(lái)將對(duì)高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株CM5進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件研究，通過(guò)對(duì)液體最佳氮碳源、pH值、培養(yǎng)濃度進(jìn)行研究，獲得酶活穩(wěn)定的高活性幾丁質(zhì)酶成品，為細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

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收稿日期：2015年9月14日。

第一作者簡(jiǎn)介：胡基華，女，1970年8月生，黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，助理研究員。E-mail：158631375@qq.com。通信作者：李晶，黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，研究員。E-mail：lijing0706@sohu.com。

1)黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項(xiàng)課題。

責(zé)任編輯：程紅。