許佳瑤　趙博　甕岳太　張月　楊波　薛煜

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

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松櫟柱銹菌春孢子顯微計數(shù)方法的篩選1)

許佳瑤趙博甕岳太張月楊波薛煜

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

摘要為了選出松櫟柱銹菌(Cronartium guercuum)春孢子破壁前的顯微計數(shù)的最佳方法。通過對4種孢子計數(shù)方法的比較，篩選出了適宜的預處理方法和計數(shù)方法。結(jié)果表明：100 mL水中加入15 g無水硫酸鋅(ZnSO4)制成的硫酸鋅溶液與無水乙醇(C2H5OH)體積比為5∶1時對松櫟柱銹菌春孢子分散效果最好。方法三最適合用于該菌銹孢子顯微計數(shù)。

關鍵詞顯微計數(shù)；松櫟柱銹菌；春孢子

分類號S763.11

Screening the Microscopic Counting Methods ofCronartiumguercuumAeciospore

Xu Jiayao, Zhao Bo, Weng Yuetai, Zhang Yue, Yang bo, Xue Yu

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：110-113.

We selected a best method to count theCronartiumguercuumaecidiospores before broken. We screened out a suitable pretreatment method and counting method with four spores counting methods. The solution, which is a mixture of 5∶1 of ZnSO4solution made from 100 mL of water added 15 g of anhydrous ZnSO4to C2H5OH in volume, has the best disperse effect toCronartiumguercuumaecidiospores. Method three is the most adaptive way toCronartiumguercuumaecidiospores microscopic counting.

KeywordsMicroscopic counting； Cronartium guercuum; Aecidiospores

松櫟柱銹菌(Cronartiumguercuum)能夠引起樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、興凱湖松(P.takahasii)等二針松的枝干病害，在東北不同地區(qū)都有大面積發(fā)生[1]。松櫟柱銹菌是一種長循環(huán)型、轉(zhuǎn)主寄生菌，性孢子、春孢子階段生長在樟子松上，夏孢子、冬孢子階段生長在蒙古櫟葉片上。一旦松樹被侵染形成腫瘤，每年春天在松樹瘤部都會產(chǎn)生桔黃色的春孢子器，腫瘤也會逐年增大，給林木生長和林分健康造成極大的影響。據(jù)邵力平等研究表明，當病級達到Ⅲ時，與正常樹木相比，結(jié)實量減少71%～92%，更新頻率減少53%，直徑年平均生長量、樹高年平均生長量、材積年平均生長量分別減少57.4%、46.4%、80.5%[2]。這種病害一旦形成很難治愈，目前沒有一種令人滿意的防治方法。能否通過對已形成的春孢子加以利用，即開發(fā)它的藥用價值造福人類又從客觀上減少病原菌的侵染源，降低病害進一步擴展，探索一條防治松瘤銹病的新途徑，是本研究的目的所在。Karo早在1903年曾報道干朽菌(Meruliuslacrymans)和白鬼筆(Phallusimpudicus)的發(fā)酵物有治癌作用，約20年后又發(fā)現(xiàn)美味牛肝菌(Boletusedulis)的提取物對小鼠肉瘤S-180有抑制作用。后來，日本和美國等對抗癌真菌進行了大量篩選，發(fā)現(xiàn)約有40屬的真菌具有抗癌活性，它們大多屬于擔子菌亞門(Basidiomycota)[3]。松櫟柱銹菌也同許多藥用、食用的真菌一樣隸屬于擔子菌亞門。薛煜[1]對該菌的春孢子進行了氨基酸含量測定，并對產(chǎn)生銹孢子的松瘤部組織和健康組織進行了解剖學研究和對比分析，發(fā)現(xiàn)春孢子的氨基酸種類很豐富，含有14種氨基酸。在松瘤部組織的粗脂肪、粗纖維、粗蛋白、總糖含量均高于健康組織，可見銹菌大量地調(diào)動了寄主組織的養(yǎng)分供其生長發(fā)育[4]。春孢子生長在春孢子器包被內(nèi)，受空氣污染可能性小，比較集中便于收集，對于開發(fā)利用提供了質(zhì)量安全保證。

由于春孢子具有由幾丁質(zhì)構成的堅硬細胞壁，具有非常穩(wěn)定的理化特性，阻止了春孢子內(nèi)含物的釋放，大大限制了春孢子的深層開發(fā)和利用，因此要提取春孢子的多糖和其他內(nèi)含物就必須對春孢子破壁。破壁春孢子過程中必須要對其進行計數(shù)，用以調(diào)整破壁的方式方法和計算物質(zhì)含量。但是，現(xiàn)行的孢子顯微計數(shù)方法并不適用于該菌的春孢子。于是，本課題組首先開展了對松櫟柱銹菌春孢子開發(fā)利用研究的第一步，即春孢子的顯微計數(shù)方法的篩選研究。

1材料與方法

1.1試驗材料及預處理

2015年5月上、中旬分別在大興安嶺塔河縣林業(yè)局棲霞山、十八站林場、沿江林場、加格達奇北山公園、呼瑪縣林業(yè)局金山林場采集新鮮松櫟柱銹菌春孢子。將春孢子掃入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，封口，帶回實驗室。將樣品過80目篩，去除春孢子器包被碎片，然后在45 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，置于密封的100 mL離心管中，于冰箱中-40 ℃保存，待用。

1.2方法

1.2.1選擇計數(shù)方法

考慮到檢驗成本、檢驗耗時、可操作性等因素，選擇光學顯微鏡計數(shù)法。

1.2.2懸浮液溶劑的選擇

松櫟柱銹菌春孢子懸浮性差，沉降速度快，大大影響觀測值的準確性。倪偉鋒對靈芝孢子粉懸浮液的研究表明，硫酸鋅溶液具有密度大、溶解度高、溶液黏度小，無毒性等優(yōu)點，對靈芝孢子懸浮較好[5]，因此，選擇用硫酸鋅溶液制備懸浮液。為了打破原有較大孢子團粒結(jié)構，將孢子懸浮液用快速混勻器混勻。

1.2.3春孢子計數(shù)

1.2.3.1孢子懸浮液的制備

取出在冰箱中密封保存的銹孢子，解凍(防止空氣中水蒸氣遇冷凝結(jié)在春孢子上，影響試驗精度)。解凍后分別稱取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g春孢子粉，置于編號為1、2、3、4、5的5個100 mL離心管中。取45.0 g無水硫酸鋅(ZnSO4)溶于300 mL水中，定容至編號為1、2、3、4、5的5個50 mL容量瓶中。將容量瓶中配制的溶液傾倒約30 mL于編號相同的裝有銹孢子的100 mL離心管中，保存好容量瓶中剩余的溶液，用封口膜密封好離心管。將編號1～5的離心管分別置于快速混勻器，混勻時間分別設置15、20、25、30 s；然后超聲振蕩處理1 h，并每隔5、10、15、20 min晃動一次離心管。最后將容量瓶中剩余的溶液全部加到對應的離心管中。每個試驗重復5次。

1.2.3.2鏡檢方法

方法一：記錄1個待測樣品在1個計數(shù)板2個計數(shù)區(qū)10個計數(shù)中格中一共出現(xiàn)的春孢子個數(shù)作為一個待測樣品的觀測值。測定之前樣品要搖勻，所選計數(shù)中格在計數(shù)區(qū)的位置如圖1A灰色區(qū)域所示。分別測定5個待測樣品，5次重復。

方法二：參照石俊英等[6]對中藥顯微定量法的研究方法和張全龍[7]采用的優(yōu)化后計數(shù)花粉方法。用移液槍準確吸取10 μL搖勻后的待測樣品置于載玻片正中央，手指托住蓋玻片的四角慢慢靠近在載玻片上的待測樣品輕輕放下，避免氣泡產(chǎn)生。鏡檢視野分布如圖1B所示。以9個視野觀測到的銹孢子個數(shù)的和作為1個樣品的觀測值?？梢允褂脦в袦y微尺的目鏡中的十字絲輔助計數(shù)。分別測定5個待測樣品，5次重復。

方法三：除計數(shù)區(qū)所選計數(shù)中格外，其他均與方法一相同，所選計數(shù)中格分布如圖1C所示。

方法四：除計數(shù)區(qū)所選計數(shù)視野分布外，其他均與方法二相同，所選計數(shù)中格分布如圖1D所示。

所有觀測結(jié)果用IBM SPSS Statistics 22軟件進行處理。

圖1　松櫟柱銹菌春孢子鏡檢方法示意圖

2結(jié)果與分析

2.1懸浮液分散度調(diào)整

通過一系列試驗摸索，用每100 mL水中加入15 g無水硫酸鋅(ZnSO4)制成硫酸鋅溶液，然后用該質(zhì)量濃度下的硫酸鋅溶液與無水乙醇以體積比為5∶1配制懸浮液。松櫟柱銹菌春孢子在上述配方的懸浮液中懸浮時間較長，說明摸索出的配方對提高春孢子在懸浮液中的分散度具有較好的現(xiàn)實作用。

由于春孢子具有較多油球[8]，因此破壁后油球散出會導致孢子粘結(jié)成團，不利于顯微鏡觀察計數(shù)。即使是不做破壁處理，當該菌春孢子粉加入硫酸鋅溶液后，大多粘結(jié)成團粒，晃動試管分散效果不明顯。因此，在硫酸鋅溶液中添加易溶于水的有機溶劑乙醇溶解油球，輔以快速混勻并與超聲波振蕩結(jié)合促使春孢子充分分散。

通過摸索試驗發(fā)現(xiàn)，20 s是最佳快速混勻時長。時間太短，原有團粒結(jié)構未有效打破，時間太長又會產(chǎn)生新的團粒結(jié)構。然后對孢子懸浮液超聲振蕩處理，用以徹底打破原有孢子團粒結(jié)構。試驗后發(fā)現(xiàn)，超聲處理1 h并每隔10 min搖勻一次效果最好。

2.2料液比與計數(shù)方法對計數(shù)結(jié)果的影響

4種方法所測定樣品的體積是不同的，得出的觀測值大小不在同一水平，所以用IBM SPSS Statistics 22對不同料液比、不同計數(shù)方法下所得到的觀測值計算均值和變異系數(shù)后再加以分析。為了更直觀地比較4種方法在不同料液比下，5次重復計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)，將原始數(shù)據(jù)處理結(jié)果整合成更適于比較分析的表1。通過比較各個計數(shù)方法在相同料液比條件下的觀測值變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)方法四在前4種料液比下計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)最小，計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性最好，而方法三計數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性在這4種方法中僅次于方法四。同時也發(fā)現(xiàn)雖然方法一在微生物顯微計數(shù)中普遍應用，方法二在花粉計數(shù)和中藥顯微定量研究中普遍應用[6，9]，但是對于松櫟柱銹菌春孢子顯微計數(shù)，方法一與方法二適用性明顯比方法三和方法四要差。

表1　料液比與計數(shù)方法共同作用下的松櫟柱銹菌春孢子觀測值與變異系數(shù)

2.3線性回歸方程的差異

將同一料液比、同一方法所得觀測值求算數(shù)平均值，以料液比為自變量x，觀測平均值為因變量y，使用Excel 2010分別求出每一種方法下的線性回歸方程。

方法一：y=15 600x+0.40(R2=0.950 0)。

方法二：y=122 000x+2.20(R2=0.999 9)。

方法三：y=70 250x+0.74(R2=0.998 0)。

方法四：y=110 500x-18.12(R2=0.955 6)。

建立某種方法的線性回歸方程可以減少計數(shù)的工作量，能實現(xiàn)料液比與觀測值之間的理論推算，而線性回歸方程對計數(shù)結(jié)果的擬合效果對于料液比與觀測值的推算精度就有較大影響，擬合方程精度越高，推算的也就越準確。通過R2值的大小比較可以看出，在其他條件均相同的情況下，擬合情況最好的是方法二，其次是方法三，擬合情況最差的是方法一。

2.4其他方面的差異

首先，這4種方法的工作量是不相同的。4種方法工作量由大到小依次為：方法二、方法四、方法三、方法一。微生物人工計數(shù)工作量的大小影響工作效率，很多計數(shù)方法因為工作量太大而被放棄。4種方法中方法三工作量僅稍大于方法一。其次，計數(shù)方法二與計數(shù)方法四的操作難度要大于方法一與方法三。其三，方法一與方法三對顯微鏡型號沒有依賴，而方法二與方法四在測定中途就不能更換顯微鏡，因為不同的顯微鏡視野面積也有差異。

3結(jié)論與討論

本試驗篩選出的懸浮液配方是用每100 mL水中加入15 g無水硫酸鋅(ZnSO4)制成硫酸鋅溶液，然后用該質(zhì)量濃度下的硫酸鋅溶液與無水乙醇以體積比為5∶1配制。加入松櫟柱銹菌春孢子之后使用快速混勻機快速混勻20 s,然后超聲處理1 h，并每隔10 min搖勻一次。

在微生物顯微計數(shù)工作中，要對微生物進行預處理，不同的微生物處理方法也不相同。本研究的4種方法使用了相同的預處理。使用硫酸鋅配置溶液使孢子更好地懸浮，降低了孢子沉降的速率，但是硫酸鋅溶液質(zhì)量濃度也不能太大，太大的硫酸鋅溶液又會使得孢子在懸浮液中分布不均，聚集在懸浮液上層。預處理中為了降低孢子油球?qū)︽咦訄F粒的影響，加入一定量的乙醇，既能以任意比例與水相溶，又能溶解孢子油球。乙醇的比例不能太高，乙醇比例高，懸浮液密度下降，反作用于硫酸鋅溶液。同時乙醇具有揮發(fā)性，比例越高越會影響計數(shù)工作的準確度。如果計數(shù)工作中無油球的影響，就不必使用乙醇。硫酸鋅溶液與乙醇的比例需要慎重掌握，比例大，無法保證對油球的溶解程度，比例小又不能保證孢子的懸浮情況。這2個變量共同決定了孢子的分散狀況。所以，在應用到其它孢子計數(shù)工作時，硫酸鋅溶液的質(zhì)量濃度與乙醇的體積分數(shù)要綜合考慮。

本試驗預處理的實質(zhì)是：配制與松櫟柱銹菌春孢子密度接近的懸浮液以保證春孢子的懸浮狀況和打破松櫟柱銹菌春孢子的團粒結(jié)構使春孢子盡可能的分散以便于計數(shù)。這是所有顯微計數(shù)方法配制懸浮液都需要考慮的2個基本點，試驗中采用的懸浮液配制思路也是所有顯微計數(shù)方法懸浮液配制的基本思路。在真菌的研究中，尤其是在真菌中研究較少的冷門物種的研究中，研究對象有時無法適應已有的研究方法，這就需要去大膽探索，開創(chuàng)能夠適應自己研究對象的研究方法，這也是科研工作者創(chuàng)新精神的體現(xiàn)。

本試驗選擇計數(shù)方法的過程中主要考慮了觀測值的穩(wěn)定性和觀測結(jié)果與料液比2個變量所擬合的函數(shù)的擬合情況。發(fā)現(xiàn)方法四在4種料液比下計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)最小，計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性最好，而方法三計數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性次之。以料液比為自變量x，觀測平均值為因變量y，求出每一種方法下的線性回歸方程，然后比較R2值的大小。通過比較可以看出，擬合情況最好的是方法二，其次是方法三，擬合情況最差的是方法一。在選擇過程中還將各個方法的工作量、所需檢測時間以及操作難度等諸多因素都納入考慮范圍，綜合考慮。通過綜合比較分析，方法三是4種顯微計數(shù)方法中最適合用于松櫟柱銹菌春孢子計數(shù)的方法。

計數(shù)方法二與計數(shù)方法四是引用花粉計數(shù)方法與中藥顯微定量的方法。花粉的直徑10～200 μm，一般為40～50 μm，雖然學術界對于花粉的計數(shù)尚未形成統(tǒng)一的標準[9]，但是引用到松櫟柱銹菌春孢子計數(shù)后表現(xiàn)出的效果很不錯，比如方法四計數(shù)結(jié)果具有很好的穩(wěn)定性。方法四用于計數(shù)其他直徑在10～200 μm的生物或者顆粒時適用性較高、適用范圍廣、觀測值穩(wěn)定，但是工作量會增大，在松櫟柱銹菌春孢子計數(shù)中不是最適合的方法。松櫟柱銹菌春孢子大小為(22～35)μm×(18～23)μm[10]，而一般科研工作中遇到的孢子遠小于松櫟柱銹菌春孢子[11]。所以在今后的科研工作中遇到與松櫟柱銹菌春孢子相近似的顯微計數(shù)對象時，也可以采用本試驗中所采用的顯微計數(shù)方法三。

雖然微生物計數(shù)已經(jīng)涌現(xiàn)出很多方法，但是這些方法專一性都較高，而且計數(shù)成本也成了重要的限制因子。顯微計數(shù)起步最早，最成熟，適用性較廣，成本低廉，仍然是當下微生物、花粉、中藥等計數(shù)和定量的主流方法。因此，完善這種方法，增大顯微計數(shù)的適用性仍然具有其自身的價值。任何一種方法都不是完美的，但是可以對現(xiàn)有的方法進一步完善，增強這些方法的實用性，拓展適用性，使其更好地為科研工作服務。

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收稿日期：2015年10月27日。

第一作者簡介：許佳瑤，女，1994年7月生，東北林業(yè)大學林學院，本科學生。E-mail：guooguoo@126.com。通信作者：薛煜，東北林業(yè)大學林學院，教授。E-mail：xueyuhenry@126.com。

1)國家級本科生創(chuàng)新項目(201510225075)。

責任編輯：程紅。