補(bǔ)肺益腎方對(duì)幼齡哮喘豚鼠模型IL-5信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制

王明明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210029)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)肺益腎方對(duì)幼齡哮喘豚鼠模型IL-5信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制

王明明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210029)

摘要：目的觀察中藥補(bǔ)肺益腎方對(duì)幼齡哮喘豚鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白介素-5(IL-5)水平以及嗜酸粒細(xì)胞(EOS)上白介素-5受體α(IL-5 R α) mRNA表達(dá)的影響，探討中藥補(bǔ)肺益腎方通過(guò)IL-5信號(hào)通路促進(jìn)哮喘EOS凋亡的機(jī)制。方法24只健康幼齡豚鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組。以卵蛋白致敏激發(fā)制備豚鼠哮喘模型，分離豚鼠BALF中的EOS，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)BALF中IL-5的含量，TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)EOS凋亡，原位雜交檢測(cè)IL-5 RαmRNA表達(dá)。結(jié)果模型組IL-5水平高于正常組(P<0.01)，中藥組IL-5水平低于模型組(P<0.05)。模型組豚鼠EOS凋亡明顯減少，中藥組EOS凋亡明顯高于模型組(P<0.01)。模型組豚鼠EOS表達(dá)IL-5 Rα mRNA明顯低于正常組(P<0.01)，中藥組EOS表達(dá) IL-5 RαmRNA明顯增加(P<0.05)。結(jié)論中藥補(bǔ)肺益腎方可通過(guò)降低氣道IL-5水平，促進(jìn)IL-5 RαmRNA表達(dá)，來(lái)促進(jìn)EOS凋亡，減輕氣道炎癥，從而達(dá)到防治哮喘的目的。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)肺益腎；哮喘；嗜酸粒細(xì)胞；白介素

哮喘是一種慢性炎癥性疾病[1]，EOS是哮喘發(fā)病機(jī)制中的一種重要炎癥細(xì)胞[2]，EOS募集于肺中并釋放炎性介質(zhì)是哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[3]，IL-5則是EOS成熟、內(nèi)皮黏附、活化等過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子[4]，是促進(jìn)哮喘氣道炎癥形成和發(fā)展的重要細(xì)胞因子[5]。中醫(yī)補(bǔ)肺益腎防治小兒哮喘療效肯定，本研究通過(guò)觀察中藥補(bǔ)肺益腎方對(duì)幼齡哮喘豚鼠IL-5水平、IL-5 Rα mRNA表達(dá)和EOS凋亡的影響，探討其通過(guò)IL-5信號(hào)通路途徑防治哮喘的機(jī)制。

1材料

1.1動(dòng)物普通級(jí)健康純白豚鼠24只，21～30日齡，雄性，體質(zhì)量(190±20)g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(蘇)2005-0009。

1.2藥物補(bǔ)肺益腎方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、紫河車(chē)等組成。補(bǔ)肺益腎方制備：將以上中藥(按處方配伍用量配制好，購(gòu)自安徽亳州市華龍中藥飲片廠)浸水 2 h，煮沸再用文火煎40 min，過(guò)濾后藥渣再次加水文火煎，重復(fù)3次，合并煎煮液，經(jīng)水浴濃縮，使終濃度相當(dāng)于每1 mL生藥2.5 g。1.3試劑與儀器卵蛋白(上海伯奧生物科技有限公司)；Percoll細(xì)胞分離液(瑞典Pharmacia公司)；多聚賴(lài)氨酸(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；豚鼠IL-5檢測(cè)試劑盒(美國(guó)ADL公司)；IL-5 R原位雜交檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；S-888E型超聲波霧化器(中外合資南京道芬電子有限公司)；LD25-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品)；OLYMPUS熒光多功能顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；美國(guó)IPP圖象分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics 公司)。

2方法

2.1分組與模型制備24只健康豚鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：正常對(duì)照組，簡(jiǎn)稱(chēng)正常組；哮喘模型對(duì)照組，簡(jiǎn)稱(chēng)模型組；補(bǔ)肺益腎方口服組，簡(jiǎn)稱(chēng)中藥組。按國(guó)際上常用的方法[6]，以卵蛋白致敏和攻擊加以復(fù)制。在實(shí)驗(yàn)的第1天，除正常組外各組豚鼠腹腔注射10%卵蛋白1 mL致敏；第15天將致敏的豚鼠置于密閉有機(jī)玻璃罩內(nèi)，給予含1%卵蛋白的生理鹽水超聲霧化吸入誘喘，直至哮喘發(fā)作，即為造模成功。此后，每周誘喘2次，使哮喘反復(fù)發(fā)作。正常組在實(shí)驗(yàn)的第1天以1 mL生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，第15天予超聲霧化等容積的生理鹽水，此后每周超聲霧化等容積的生理鹽水2次。

2.2干預(yù)方法實(shí)驗(yàn)第16天，即第1次誘喘次日始治療，中藥組以補(bǔ)肺益腎方(9.2 g/kg)灌胃，2次/d，療程2周，最后1次誘喘前12 h停止治療。正常組和模型組均不治療。

2.3觀察指標(biāo)及方法

2.3.1支氣管肺泡灌洗實(shí)驗(yàn)第29天，給予各組豚鼠最后1次誘喘，于24 h后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，麻醉成功后將其固定于操作臺(tái)上，沿頸正中線剪開(kāi)皮膚，分離氣管，剪一切口行氣管插管，然后用4 ℃RPMI-1640培養(yǎng)液5 mL從氣管注入，共3次，輕輕按摩豚鼠胸部20～30 s后緩慢回抽，回收后的肺泡灌洗液1 300 r/min,20 min離心，上清液-20 ℃保存，用于檢測(cè)IL-5，沉淀細(xì)胞用1 mL PBS重新懸浮，等待分離嗜酸性粒細(xì)胞。

2.3.2嗜酸性細(xì)胞分離按文獻(xiàn)[7]配制不同密度的細(xì)胞分離液。在離心管中依次加入1.100、1.085的Percoll液各1 mL，最后加入上述細(xì)胞懸液1 mL，用2 000 r/min ，20 min，20 ℃離心?；厥杖?種密度Percoll液介面之間的EOS，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，將EOS涂在預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸黏附劑處理過(guò)的玻片上，4%多聚甲醛固定30 min。

2.3.3ELISA法IL-5水平檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.3.4IL-5 R原位雜交檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，光鏡下觀察IL-5 R α mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，每張涂片在高倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞以上，計(jì)數(shù)各組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

2.3.5TUNEL法原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，光鏡下觀察陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，每張涂片在高倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞以上，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率。凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

3 結(jié)果

3.1對(duì)各組豚鼠BALF中IL-5的影響見(jiàn)表1。

表1　各組豚鼠BALF中IL-5水平　pg/mL

注：與正常組比較,#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較,△P<0.05

3.2對(duì)各組豚鼠BALF中EOS IL-5 RαmRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表2。

表2　各組豚鼠BALF中EOS IL-5 RαmRNA表達(dá)水平

注：與正常組比較,#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較,△P<0.05

3.3對(duì)各組豚鼠BALF中EOS凋亡的影響見(jiàn)表3。

表3　各組豚鼠BALF中EOS 凋亡水平

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01

4討論

EOS浸潤(rùn)是哮喘過(guò)敏性炎癥的病理特征[8]，是氣道炎癥的中心環(huán)節(jié)[9]，能夠反映支氣管哮喘患兒的氣道炎癥程度[10]，哮喘的嚴(yán)重程度取決于EOS在呼吸道內(nèi)的浸潤(rùn)與活化[11]，其他哮喘病程中的炎性細(xì)胞最終通過(guò)EOS而產(chǎn)生效應(yīng)，炎性細(xì)胞凋亡可與炎癥反應(yīng)消退有關(guān)[12-13]。IL-5由Th2細(xì)胞分泌[14]，是形成嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞因子[15]，能夠與EOS表面受體結(jié)合，對(duì)EOS的分化、成熟、黏附、浸潤(rùn)、凋亡有獨(dú)特作用[16]。氣道中的EOS來(lái)源于外周血和嗜酸粒細(xì)胞前體祖細(xì)胞，嗜酸粒細(xì)胞前體祖細(xì)胞在骨髓生成[17]，細(xì)胞表面表達(dá)IL-5Rα，氣道炎癥時(shí)嗜酸粒細(xì)胞前體祖細(xì)胞由于致敏原的刺激通過(guò)細(xì)胞表面eotaxin受體CCR3的作用從骨髓遷移到氣道中，并在IL-5的作用下分化成熟為成熟EOS并直接被激活[18]。因此IL-5可將EOS募集和遷移入呼吸道并對(duì)維持炎癥反應(yīng)具有正向調(diào)控作用[19]，而募集至氣道的EOS又能分泌IL-5，如此惡性循環(huán)，導(dǎo)致了氣道的慢性炎癥，所以IL-5成為調(diào)節(jié)EOS介導(dǎo)的哮喘炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)[20]。而EOS膜表面有IL-5的受體，IL-5受體α鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能產(chǎn)生可溶型α受體，可溶型α受體分泌至體液中與IL-5結(jié)合，就可阻滯IL-5對(duì)EOS的活化，起到負(fù)性調(diào)節(jié)劑的作用，從而降低了IL-5的生物學(xué)作用[21]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用中藥補(bǔ)肺益腎方后哮喘豚鼠肺內(nèi)IL-5含量減少，EOS表達(dá)IL-5可溶性受體增加，減弱IL-5生物學(xué)功能，這兩者都可影響EOS活性，使EOS凋亡加速，有利于肺內(nèi)EOS清除，減輕氣道炎癥。

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Regulating mechanism of traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney on IL-5 signal pathway of young guinea pigs with asthma

WANG Mingming

(First Clinical Medical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of the traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney on interleukin-5 level and expression of IL-5 receptor α mRNA in eosinophils (EOS) of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)of young guinea pigs with asthma and to explore the mechanism of the traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney in promoting eosinophil apoptosis by IL-5 signal pathway.MethodsThe 24 young guinea pigs were divided into three groups randomly,normal control group,model group and the traditional Chinese medicine group.Asthma model of guinea pigs were sensitized by ovalbumin.EOS was purified from BALF.The content of IL-5 in BALF was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Apoptosis was detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Expressions of IL-5 IL-5Rα mRNA were measured by bridization.ResultsThe content of IL-5 in model group was higher than that of normal group(P<0.01),while the content of IL-5 in the traditional Chinese medicine group was lower than that of model group(P<0.05).EOS apoptosis in model group guinea pig were significantly decreased,while EOS apoptosis in the traditional Chinese medicine group guinea pig were higher than that of model group(P<0.01).Expressions of IL-5Rα mRNA in EOS from model group were remarkably lower than that of normal group(P<0.01),while expressions of IL-5 R α mRNA in EOS from the traditional Chinese medicine group were increased(P<0.05).ConclusionThe traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney promotes eosinophil apoptosis by decreasing the content of IL-5 in airway and increasing expressions of IL-5 R α mRNA.So it can relieve airway inflammation and prevent asthma.

Keywords：invigorate lung and nourish kidney;asthma;eosinophil;interleukin

(收稿日期:2015-08-10)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)02-0234-04

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡(jiǎn)介：王明明(1968-)，女，博士，副教授，副主任中醫(yī)師，主要從事小兒肺系疾病研究。

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(07KJB360089)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.005