李楊 安方玉 明海霞 劉永琦

摘要：目的 觀察黃芪多糖對中波紫外線（UVB）輻射損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）的影響，初步探討其作用機制。方法 采用UVB輻射HaCaT細(xì)胞進(jìn)行造模。分為空白對照組、模型組、陽性對照組及黃芪多糖低、中、高劑量組，各藥物組給予相應(yīng)藥物干預(yù)。MTT法測定細(xì)胞活力；生化比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；ELISA檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量。結(jié)果 與空白對照組比較，模型組SOD、CAT、GSH-Px含量降低，MDA、TNF-α、IL-6含量升高（P<0.05）；與模型組比較，各藥物組SOD、GSH-Px、CAT含量升高，MDA、TNF-α、IL-6含量降低（P<0.01）。結(jié)論 黃芪多糖可在一定程度上減輕UVB對HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；中波紫外線；皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞；保護(hù)作用

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0044-03

Effects of Astragalus Polysaccharides on Damage of Keratinocytes in UVB Radiation Skin LI Yang， An Fang-yu， Ming Hai-xia， LIU Yong-qi （Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and the Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Astragalus polysaccharide （APS） on damage of keratinocytes in ultraviolet B （UVB） radiation skin in HaCaT cells； To preliminarily explore its mechanism of action. Methods HaCaT cells were treated by UVB irradiated for modeling. Blank control group， model group， UVB irradiation group and low-， medium- and high-dose APS interventional groups were set up. Each medication group was given relevant medicine. MTT assay was used to determine the cell activity； GSH-Px， CAT， SOD activity and MDA content were detected by biochemical colorimetric method； contents of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the contents of SOD， CAT and GSH-Px in the model group decreased significantly， while the contents of MDA， TNF-α and IL-6 increased significantly （P<0.05）； compared with the mode group， the contents of SOD， CAT and GSH-Px in the medication groups increased significantly， while the contents of MDA， TNF-α and IL-6 were reduced significantly （P<0.01）. Conclusion APS can reduce the oxidative stress injury of UVB to HaCaT cells to some extent.

Key words： Astragalus polysaccharides； ultraviolet B； HaCaT cells； protective effect

黃芪為豆科草本植物內(nèi)蒙黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var. mongholicus（Beg.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）

基金項目：甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室培育基金項目（2013年）

通訊作者：劉永琦，E-mail：liuyongqi73@163.com

Bge.的干燥根，有補氣固表、托毒排膿、斂瘡生肌等功效。黃芪含有多糖、皂苷、黃酮等多種有效成分，其中黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是其主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)機體免疫等功效。黃芪作為增強體質(zhì)、扶正固本、延年益壽之要藥，古今中外研究諸多，但尚未見抗紫外線損傷的相關(guān)研究報道。本實驗在體外培養(yǎng)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞），以一定劑量中波紫外線（UVB）輻射建立模型，觀察APS對UVB輻射損傷皮膚HaCaT的影響，初步探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

APS，陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，批號Uhqdt130527；使用時將APS干粉劑用生理鹽水溶解，滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；維生素C片，廣東華南藥業(yè)有限公司，批號140406。

1.2 細(xì)胞株

HaCaT細(xì)胞株，上海軒研生物科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清、HyClone High Glucose DMEM、磷酸鹽緩沖液（PBS），賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶，Gibco公司；過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒，北京福瑞生物工程公司。紫外分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），UVB輻射度監(jiān)視器、SUV-100UVB輻射儀（美國SIGMA公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（香港力康發(fā)展有限公司），超速離心機（金壇市恒豐儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中（含青、鏈霉素各100 IU/mL），37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，加2 mL胰酶，置于孵育箱中消化10 min，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙變大時加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，用無菌吸管吹打成單個細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液并加入培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，以1∶2比例傳代，獲得足夠的細(xì)胞用于實驗。取對數(shù)生長期3～5代的HaCaT細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，分為空白對照組、模型組、陽性對照組和APS低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M為正常培養(yǎng)細(xì)胞；模型組細(xì)胞以紫外線輻射損傷細(xì)胞[1]；APS低、中、高劑量組細(xì)胞分別在APS 100、200、400 μg/mL培養(yǎng)液中預(yù)孵育24 h后，分別以紫外線輻射損傷細(xì)胞；陽性對照組細(xì)胞在含有5.68 mmol/L維生素C的培養(yǎng)液中預(yù)孵育24 h后，紫外線輻射損傷。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，空白對照組用錫箔紙遮蓋，其余各組UVB照射前吸取培養(yǎng)液并加入PBS覆蓋細(xì)胞上層，以避免細(xì)胞干燥，暴露于15 W UVB燈管下輻照，距離20 cm，時間30 min，輻射總劑量分別為30 mJ/cm2 UVB和60 mJ/cm2 UVB后棄去PBS，再分別加入培養(yǎng)液，空白對照組和模型組加入等量培養(yǎng)液，各藥物組棄去PBS，加入含藥物DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。

2.2 MTT法測定HaCaT細(xì)胞活力

各孔加MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止，吸去上清液并加200 μL DMSO，常溫振蕩15 min，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測定各孔吸光度（OD）值，記錄結(jié)果。

2.3 指標(biāo)檢測

收集各組細(xì)胞上清液，生化比色法測定SOD、GSH-Px、CAT、MDA含量，ELISA檢測TNF-α、IL-6含量，均嚴(yán)格參照試劑盒說明進(jìn)行檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃芪多糖對HaCaT細(xì)胞活力的影響

MTT測定結(jié)果顯示，當(dāng)UVB輻射為0 mJ/cm2時，各藥物組細(xì)胞活力與模型組比較無明顯差異，說明所加藥物對正常的HaCaT細(xì)胞無毒性作用；經(jīng)不同劑量UVB輻射后，模型組細(xì)胞活力明顯低于APS中、高劑量組和陽性對照組（P<0.05，P<0.01），說明APS可降低UVB對HaCaT細(xì)胞活力的抑制作用。結(jié)果見表1。

4.2 黃芪多糖對HaCaT細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)含量的影響

與空白對照組比較，模型組SOD、CAT、GSH-Px含量均顯著降低，MDA、TNF-α、IL-6含量均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，APS高、中劑量組和陽性對照組SOD、GSH-Px、CAT含量均顯著升高，MDA、TNF-α、IL-6含量均顯著降低（P<0.01）；APS中、高劑量組和陽性對照組比較，各項指標(biāo)無明顯差異。結(jié)果見表2、表3。

5 討論

UVB主要的靶細(xì)胞是HaCaT細(xì)胞，UVB可造成HaCaT細(xì)胞生物學(xué)特性的一些改變，導(dǎo)致各種皮膚病。因此，UVB在紫外線對皮膚損傷中占重要地位。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，正氣虧虛，邪氣乘虛而入，皮膚病的發(fā)生是機體脾肺功能下降，調(diào)節(jié)失衡所致；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，當(dāng)免疫系統(tǒng)失去監(jiān)控功能就會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，這一觀點與中醫(yī)學(xué)理論相一致。近年來，中藥對皮膚的光保護(hù)作用日益受到重視和應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪制劑有抗皮膚老化和抗紫外線的作用[2]。依據(jù)黃芪“走表”的中醫(yī)理論，辨證采用“補法”調(diào)節(jié)脾肺之氣，運用其調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用，治療多種皮膚病均取得了滿意的療效[3]。

暴露在皮膚的HaCaT細(xì)胞很容易受到各種物理、化學(xué)因素的侵襲并產(chǎn)生氧化應(yīng)激性的損傷。正常的皮膚細(xì)胞有較完善的氧化/抗氧化系統(tǒng)，這些防御系統(tǒng)包括SOD、GSH-Px、CAT等。SOD是機體有效清除活性氧重要酶類之一，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，是體內(nèi)抗氧化酶體系的重要組成部分，其含量可間接反映機體清除氧自由基的能力。張氏等[4]研究發(fā)現(xiàn)，APS通過提高SOD含量，加強對氧自由基的清除作用，從而發(fā)揮其抗氧化的作用。GSH-Px是機體內(nèi)存在的催化H2O2分解的酶，可保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能的完整；CAT是一種酶類清除劑，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，它促使H2O2分解為氧分子和水，清除機體內(nèi)的H2O2，可使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害；MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，它是氧化過程中的最終產(chǎn)物之一，是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而形成的過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物。HaCaT細(xì)胞在UVB輻射后可釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等多種促炎癥因子。TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中心之一，可導(dǎo)致其他多種細(xì)胞因子的釋放引起細(xì)胞凋亡；IL-6是角質(zhì)形成細(xì)胞與成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路的中介物質(zhì)，是機體免疫防御、炎癥損傷中的重要介質(zhì)，其主要免疫學(xué)功能是加強其他細(xì)胞因子的效果，IL-6分泌或基因表達(dá)異常均可導(dǎo)致一系列疾病。本實驗結(jié)果顯示，APS能提高HaCaT細(xì)胞SOD、GSH-Px、CAT的含量，降低MDA、TNF-α和IL-6的含量。

綜上，APS可在一定程度上減輕UVB對HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷，增強細(xì)胞抗氧化能力，降低炎癥細(xì)胞因子的分泌，減輕細(xì)胞受損程度。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高薇，侯微，李偉，等.UVB輻射HaCaT細(xì)胞損傷模型的建立[J].中藥藥理與臨床，2014，30（5）：136-139.

[2] 陳斌，康健，呂中明，等.黃芪甲甙對中波紫外線損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2009，8（1）：1-4.

[3] 沈曉峰，房新志，宋東.黃芪在皮膚病治療中的應(yīng)用[J].新疆中醫(yī)藥， 2000，18（2）：57-59.

[4] 張灼，陳立新，宋崇順，等.黃芪多糖對大鼠心肌缺血-再灌注損傷后的保護(hù)作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（2）：33-34.