槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物抑制乳腺癌MCF—7細(xì)胞遷移/侵襲及相關(guān)因子的研究

周蓉蓉 高鵬飛 張文意 張艷聰 馬維維 劉秋雨 史新元 連增林

摘要：目的 觀察槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲和相關(guān)因子的影響，探討其相關(guān)機(jī)制。方法 以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、板藍(lán)根組、槐耳組和槐耳板藍(lán)根組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞遷移能力；Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞侵襲能力；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞黏附能力；半定量RT-PCR檢測(cè)MCF-7細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）和波形蛋白（Vimentin）基因表達(dá)。結(jié)果 與板藍(lán)根組和槐耳組比較，槐耳板藍(lán)根組明顯抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和黏附（P<0.05），抑制MMP-9和Vimentin的基因表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論 槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物可能通過(guò)下調(diào)MMP-9和Vimentin的基因表達(dá)抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲。

關(guān)鍵詞：槐耳；板藍(lán)根；雙向發(fā)酵；乳腺癌；遷移；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶；波形蛋白

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）05-0064-05

Effects of Trametes Robiniophila Murr and Isatidis Radix Bidirectional Fermentation Products on Migration/Invasion of Human Breast Cancer MCF-7 Cells and Relevant Factors ZHOU Rong-rong1， GAO Peng-fei1， ZHANG Wen-yi1， ZHANG Yan-cong1， MA Wei-wei1， LIU Qiu-yu1， SHI Xin-yuan1， LIAN Zeng-lin2 （1. School of Pharmaceutical Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Handian Group， Beijing 100103， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells and relevant factors； To discuss relevant mechanism of action. Methods Breast carcinoma cell line MCF-7 was used as research subject in this experiment. Control group， Isatidis Radix group， Trametes robiniophila Murr group， and Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix group were included in the experiment. The effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on MCF-7 cell proliferation were measured by MTT method. Cell scratch assay， transwell assay and adhesion assay were used to measure the effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the migration， invasion and adhesion capability of MCF-7 cells， respectively. The effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the mRNA expression of MMP-9 and Vimentin were measured by RT-PCR. Results Compared with Isatidis Radix group and Trametes robiniophila Murr group， Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products could significantly inhibit the proliferation， migration， invasion and adhesion capability of MCF-7 cells （P<0.05）. Similarly， Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products reduced the mRNA expression of MMP-9 and Vimentin （P<0.05）. Conclusion Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products may down-regulate the expression of MMP-9 and Vimentin to inhibit the migration， invasion and adhesion capabilities of MCF-7 cells.

Key words： Trametes robiniophila Murr； Isatidis Radix； bidirectional fermentation； breast cancer； migration； invasion； MMP-9； Vimentin

基金項(xiàng)目：北京市科技新星計(jì)劃交叉學(xué)科項(xiàng)目（xxhz201210）

通訊作者：史新元，E-mail：xyshi@126.com；連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com

槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵產(chǎn)物是基于20世紀(jì)80年代莊毅教授創(chuàng)立的現(xiàn)代中藥新型雙向發(fā)酵技術(shù)研制而成[1]。槐耳菌適應(yīng)性廣泛，在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，具有較好的輔助抗腫瘤作用[2-5]。板藍(lán)根含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其化學(xué)成分基礎(chǔ)研究已較為成熟，且其所含化學(xué)成分靛玉紅已被證實(shí)具有提高免疫及抗腫瘤作用[6]。故采用具有一定活性成分的板藍(lán)根作為藥性基質(zhì)，將槐耳和板藍(lán)根作為一對(duì)組合開展雙向發(fā)酵研究，以期發(fā)生增強(qiáng)藥效的協(xié)同作用，獲得更好的生物學(xué)效應(yīng)。本課題組前期研究表明，發(fā)酵過(guò)程中菌質(zhì)（靛藍(lán)、靛玉紅、精氨酸為主成分）薄層斑點(diǎn)隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)規(guī)律變化，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，有新的斑點(diǎn)出現(xiàn)[7]。上述結(jié)果提示在雙向發(fā)酵過(guò)程中槐耳對(duì)板藍(lán)根藥材中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，并具有合成新化合物的能力。本研究以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對(duì)象，分析槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)其遷移、侵襲及相關(guān)因子的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及制備

槐耳，東北食藥真菌研究所。板藍(lán)根，安國(guó)市萌露中藥飲片有限公司，經(jīng)北京漢典中醫(yī)研究院劉曄老師鑒定，符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)?；倍逅{(lán)根雙向發(fā)酵提取物：采取醇提、水提相結(jié)的方法，將槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵產(chǎn)物中的藥效物質(zhì)充分提取，最后經(jīng)干燥制成提取物。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS，Hyclone，SH30070.03），0.25%胰蛋白酶（Hyclone，SH40003.01B），MTT（Amresco，0793-5g），二甲基亞砜（DMSO，Amresco，0231），MEM培養(yǎng)液（Hyclone，SH30024.01B），青鏈霉素混合液（Solarbio，P1400-100），25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管、Transwell小室（Corning），結(jié)晶紫染液（Sigma公司），PCR試劑盒（TaKaRa，RR019A），Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）。

YT-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司），MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學(xué)），MULTLSKAN MK3酶標(biāo)儀（Thermo），LXJ-ⅡA型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），BIOMATE型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），JY600電泳儀（北京君意東方電子設(shè)備有限公司），ChampGel 5000型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），照相機(jī)（日本Canon）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖作用

MCF-7細(xì)胞第3代經(jīng)胰酶消化，用普通培養(yǎng)液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸鏈霉素的MEM培養(yǎng)液）稀釋成2.5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行分組處理：對(duì)照組換用普通培養(yǎng)液，藥物干預(yù)組換用含槐耳、板藍(lán)根及槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物培養(yǎng)液各4 mg/mL。每組6個(gè)復(fù)孔，每孔加入上述培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，室溫下振蕩15 min混勻。待沉淀完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD值空白孔-OD值測(cè)量孔）÷（OD值空白孔-OD值調(diào)零孔）×100%。

槐耳、板藍(lán)根和槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物藥液的制備：取槐耳、板藍(lán)根和槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物各0.5 g，溶于10 mL無(wú)血清MEM培養(yǎng)基液，搖勻，于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，4000 r/min離心10 min，取上層液于50 mL離心管中，另取10 mL無(wú)血清MEM培養(yǎng)基液，對(duì)下層沉淀再溶解，4000 r/min離心10 min，取上層液于50 mL離心管中，合并2次溶液，加無(wú)血清MEM培養(yǎng)基液至45 mL，另加5 mL FBS，得到10 mg/mL槐耳、板藍(lán)根和槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物母液（含10%FBS），0.45 μm濾器過(guò)濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞遷移能力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔中，2 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板后，吸棄上清液，用10 μL吸頭在6孔板上畫“一”字，PBS輕輕沖洗2次。對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組分別加入終濃度為4 mg/mL板藍(lán)根、槐耳和槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無(wú)FBS），各3個(gè)復(fù)孔，在100倍倒置顯微鏡下，分別于藥物作用0、12、24 h時(shí)拍照，計(jì)算細(xì)胞愈合率（%）[（藥物作用前痕跡寬度-藥物作用后痕跡寬度）÷藥物作用前痕跡寬度×100%]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室及24孔板預(yù)冷，用無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶5將Matrigel膠稀釋，每個(gè)Transwell小室鋪膠60 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜干燥，使用前無(wú)血清培養(yǎng)基水化30 min。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，2 mL/孔，普通培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜后，對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組分別加入終濃度為4 mg/mL板藍(lán)根、槐耳和槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無(wú)FBS），設(shè)2個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待藥物作用MCF-7細(xì)胞48 h后，PBS洗2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，MEM培養(yǎng)基（含1%BSA）重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整MCF-7細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，Transwell小室下室加750 μL含10%FBS的MEM培養(yǎng)基，接種細(xì)胞，取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗2次，甲醇固定20 min，PBS洗2次，風(fēng)干，用0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，用濕棉簽擦盡上室面的Matrigel基質(zhì)膠和細(xì)胞，用清水洗3次，風(fēng)干。將小室置于倒置顯微鏡下，PBS洗2次，選擇中及上、下、左、右共5個(gè)象限計(jì)數(shù)，小室下室面細(xì)胞數(shù)即為穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞黏附能力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，2 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待24 h后，對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組分別加入終濃度為4 mg/mL板藍(lán)根、槐耳和槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無(wú)FBS），設(shè)2個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物作用48 h后收集細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清液，10%FBS的MEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于24孔板，每孔加1 mL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，PBS洗3次，洗去未黏附細(xì)胞。甲醇固定20 min（或95%乙醇固定10 min），用0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，清水洗3次，風(fēng)干，拍照，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（對(duì)照組細(xì)胞黏附數(shù)-藥物干預(yù)組細(xì)胞黏附數(shù)）÷對(duì)照組細(xì)胞黏附數(shù)×100%]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 RT-PCR檢測(cè)MCF-7細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9和波形蛋白基因表達(dá)

將5×105個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，普通培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜后，根據(jù)分組換用不同培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)細(xì)胞，采用Trizol兩步法提取MCF-7細(xì)胞內(nèi)的總RNA，測(cè)定OD260/OD280，計(jì)算總RNA純度和濃度。按試劑盒說(shuō)明合成cDNA第1鏈，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃（β-actin）、60.5 ℃（MMP-9）、56.4 ℃（Vimentin）退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸5 min，4 ℃冷卻。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，Gene Snap凝膠成像系統(tǒng)照相并進(jìn)行灰度值分析，以條帶OD值代表其目的片段的表達(dá)量，以內(nèi)參照β-actin的量校正，取二者OD值之比進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物信息見(jiàn)表1。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

各藥物處理MCF-7細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖能力被明顯抑制（P<0.05）；與槐耳組和板藍(lán)根組比較，槐耳板藍(lán)根組抑制作用更強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.2 槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕24 h后，對(duì)照組痕跡幾乎完全愈合，槐耳板藍(lán)根組和槐耳組痕跡愈合率均明顯下降，板藍(lán)根組作用不明顯，提示槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物具有明顯抑制細(xì)胞遷移的作用（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

4.3 槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

藥物作用48 h后，與對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞侵襲能力明顯降低（P<0.05）；與板藍(lán)根組和槐耳組比較，槐耳板藍(lán)根組明顯抑制細(xì)胞侵襲能力（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

4.4 槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞黏附能力的影響

藥物作用48 h后，與對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞黏附能力明顯降低（P<0.05）；與板藍(lán)根組和槐耳組比較，槐耳板藍(lán)根組明顯抑制細(xì)胞黏附能力（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

5 討論

本研究選擇槐耳和板藍(lán)根進(jìn)行雙向發(fā)酵研究除考慮微生物可能改變板藍(lán)根的物質(zhì)基礎(chǔ)外，還包含了2味中藥的配伍思路，旨在研究現(xiàn)代炮制技術(shù)的同時(shí)探討其可能存在的中藥協(xié)同作用及兩者配伍的科學(xué)性。板藍(lán)根具有清熱解毒、抗炎消腫、涼血利咽之功；槐耳能治風(fēng)、破血、益力，具有增強(qiáng)免疫作用。二者配伍可能具有扶正祛邪的協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖作用明顯優(yōu)于2種藥物單獨(dú)干預(yù)，表明選擇槐耳和板藍(lán)根進(jìn)行雙向發(fā)酵研究是可行有效的。

腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是癌癥患者死亡的重要原因之一，研究表明，MMP-9和MMP-2與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切，MMPs與乳腺癌及其他腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-9]。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是腫瘤轉(zhuǎn)移的天然屏障，腫瘤突破基底膜，進(jìn)入ECM是癌癥發(fā)生遷移和侵襲的第一步。MMP分子中，MMP-9是分子量最大的酶，以酶原的形式分泌到胞外，MMP-9被激活后能夠降解和破壞腫瘤表面的ECM和基底膜，使癌細(xì)胞沿缺失的基底膜向周圍組織侵襲[10]。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變（EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的一個(gè)關(guān)鍵步驟[11]。Vimentin是成纖維細(xì)胞中等纖維的主要構(gòu)成成分之一，EMT發(fā)生時(shí)會(huì)使Vimentin表達(dá)水平顯著升高[12]。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物可顯著抑制細(xì)胞愈合及其穿過(guò)基質(zhì)膜的數(shù)量和細(xì)胞貼壁能力，表明槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物抑制MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力強(qiáng)于槐耳和板藍(lán)根、二者配伍雙向發(fā)酵具有更好的抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的藥效作用?；倍逅{(lán)根雙向發(fā)酵提取物可能通過(guò)抑制MMP-9和Vimentin基因表達(dá)抑制MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，槐耳板藍(lán)根雙向發(fā)酵提取物可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)某些遷移和侵襲相關(guān)因子的基因表達(dá)，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲力，從而發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。提示中藥雙向發(fā)酵能夠增強(qiáng)藥物效果，比單獨(dú)用藥效果更好，符合中醫(yī)配伍增效減毒的理論，值得今后深入研究。

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