黨參水提物對(duì)D—半乳糖致衰老小鼠腎組織microRNA表達(dá)譜的影響

王晶 黃勇 李海龍 林志艷 田一虹 陳徹

摘要：目的 觀察黨參水提物對(duì)衰老模型小鼠腎組織microRNA（miRNA）表達(dá)譜的影響，探討黨參抗衰老的分子機(jī)制。方法 采用皮下注射D-半乳糖溶液制造衰老模型。將100只昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和黨參低、中、高劑量組，每組20只。黨參各組給予相應(yīng)劑量黨參水煎液灌胃干預(yù)，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)42 d。生化分析儀測(cè)定小鼠血清尿素（BUN）和肌酐（CREA）含量；利用AffymetrixmiRNA 4.0微陣列芯片篩選D-半乳糖致小鼠衰老和黨參干預(yù)衰老過(guò)程中差異表達(dá)的miRNA，并利用生物信息學(xué)工具對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行聚類及信號(hào)通路分析。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠血清BUN和CREA含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黨參各劑量組小鼠血清BUN和CREA含量呈下降趨勢(shì)，其中黨參高劑量組BUN下降較顯著（P<0.05）；芯片聚類分析顯示，模型組miRNA表達(dá)譜與正常組和黨參高劑量組明顯分開(kāi)，而黨參高劑量組和正常組miRNA表達(dá)譜聚在一起；另外，模型組比正常組有36個(gè)差異表達(dá)miRNA，其靶基因參與到10個(gè)主要的生物學(xué)功能中；黨參高劑量組比模型組有34個(gè)差異表達(dá)miRNA，其靶基因的生物學(xué)功能分析與模型組比正常組的分析結(jié)果相同。結(jié)論 在抗衰老過(guò)程中，黨參不僅影響了miRNA表達(dá)譜的變化，也影響了其作用的功能環(huán)境。

關(guān)鍵詞：黨參；抗衰老藥；microRNA表達(dá)譜；芯片；小鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）05-0069-04

Effects of Aqueous Extracts of Codonopsis Radix on MicroRNA Expression Profiling of D-galactose Induced Kidney of Aging Mice WANG Jing1， HUANG Yong1， LI Hai-long2， LIN Zhi-yan1， TIAN Yi-hong1， CHEN Che1 （1. School of Medical Examination， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To explore the effects of aqueous extracts of Codonopsis Radix on D-galactose induced aging model mice； To discuss the anti-aging molecular mechanism of Codonopsis Radix. Methods Subcutaneous injection of D-galactose solution was used to establish aging models. 100 Kunming mice were divided into normal control group， model group and low-， medium-， high-dose of Codonopsis Radix interventional groups randomly， 20 mice in each group. Low-， medium-， high-dose of Codonopsis Radix interventional groups were given relevant dosage for gavage， while normal control group and model group were given the same volume of NS by gavage for 42 d. After treatment for 42 days， the BUN and CREA in mouse serum were examined； the AffymetrixmiRNA 4.0 microarray was employed to identify the differentially expressed microRNA （miRNA） related with these processes； the bioinformatic tools were also used to further analyze the cluster of miRNA microarrys and the pathways which the target genes of miRNA were involved in. Results Compared with normal control group， the levels of BUN and CREA in mouse serum increased in model group （P<0.05）； compared with model group， the levels of BUN and CREA in Low-， medium-， high-dose of Codonopsis Radix interventional groups decreased， in which high-dose of Codonopsis

基金項(xiàng)目：甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（ZYFYZH-KJ-2015-008）；甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目（2013A-087）

通訊作者：陳徹，E-mail：Chen72123@163.com

Radix could most significantly inhibit the level of BUN （P<0.05）； the cluster analysis showed the miRNA expression profilings of high dose of Codonopsis Radix interventional group and normal control group were brought together， while the profiling of model group was clearly divided with the other groups. In model group vers normal control group， 36 differentiated expressed miRNA showed， which predicated in 10 main biological functions. In high-dose of Codonopsis Radix interventional group vers model group， 34 differentiated expressed miRNAs in high-dose of Codonopsis Radix interventional group showed， and the analytical results of biological functions of target genes were the same as those of model group vers normal control group. Conclusion In the anti-aging process， Codonopsis Radix can not only influence the miRNA expression profiling， but also influence its functional environment.

Key words： Codonopsis Radix； anti-aging medicine； microRNA expression profiling； microarray； mice

黨參具有補(bǔ)益精氣、養(yǎng)血生津之效，是傳統(tǒng)的補(bǔ)氣中藥。有研究顯示，黨參提取物可以延緩衰老[1]。目前，有關(guān)黨參抗衰老機(jī)制研究，主要在某一方面或某一層次上分析黨參抗衰老的作用機(jī)制[2]，但中藥的特點(diǎn)在于成分復(fù)雜、靶點(diǎn)多、作用層次廣，所以很多有用信息被遺漏。microRNA（miRNA）是一類在人類發(fā)育、衰老和腫瘤中起基因表達(dá)調(diào)控作用的非編碼小RNAs，是近年來(lái)生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。因此，本研究利用生物芯片和生物信息學(xué)工具分析黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腎組織miRNA表達(dá)譜的影響，并進(jìn)行miRNA靶基因功能分析，擬從miRNA組學(xué)水平探討黨參抗衰老作用的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠100只，2月齡，雌雄各半，體質(zhì)量（18±2）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（甘）2011-0001。室溫20～25 ℃，自由飲水、攝食，自然光照。

1.2 藥物及制備

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室杜弢教授鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，過(guò)濾，濃縮成含原藥材0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，水煎液? d制備1次。

1.3 主要試劑與儀器

D-半乳糖，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)24895207，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用。尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物有限公司，批號(hào)分別為ml016913、ml016916。BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XYJ80-20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠；7020-020型全自動(dòng)生化分析儀，日立公司；GeneChip? Scanner 3000激光掃描儀，美國(guó)Affymetrix公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組

采用頸背部皮下注射D-半乳糖溶液制作衰老模型，給藥劑量為每日每只小鼠50 g/L D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g。將100只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和黨參低、中、高劑量組，每組20只，雌雄各半。黨參低、中、高劑量組予5、10、15 g /kg黨參溶液灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)42 d。

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠處死前，先尾靜脈取血1 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，用生化分析儀測(cè)定BUN和CREA含量。

2.3 miRNA芯片檢測(cè)

利用液氮和Trizol提取各組小鼠腎組織總RNA，采用AffymetrixmiRNA 4.0微陣列芯片（北京國(guó)家工程研究中心提供），共有探針數(shù)目30 424條（包含所有物種）進(jìn)行檢測(cè)分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照博奧AffymetrixmiRNA 4.0微陣列芯片實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。雜交完成的芯片采用掃描儀進(jìn)行掃描，再用Affymetrix? GeneChip?Command Console?Software對(duì)掃描得到的芯片圖像進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)歸一化和“壞點(diǎn)”剔除，選擇熒光信號(hào)值≥1000，Cy5/Cy3≥2.0或≤0.5的miRNA為表達(dá)差異miRNA。

2.4 生物信息學(xué)分析

利用Cluter V3.0對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；采用Argonaute數(shù)據(jù)庫(kù)（該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的miRNA靶基因是已被文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)的）分析差異表達(dá)miRNA的靶基因[4]，在此基礎(chǔ)上利用博奧晶芯生物分子功能注釋系MAS V4.0（http：//bioinfo.capitalbio. com/mas/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫(kù)，分析miRNA靶基因所參與的信號(hào)通路[5]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2007軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黨參對(duì)模型小鼠腎功能的影響

造模4周后，模型小鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、皮毛疏松欠光澤等衰老癥狀。與正常組比較，模型組小鼠BUN和CREA含量明顯升高（P<0.05）；黨參各劑量組小鼠血清BUN和CREA含量較模型組均有下降趨勢(shì)，其中黨參高劑量組BUN下降明顯（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 黨參對(duì)模型小鼠腎組織miRNA表達(dá)譜的影響

提取正常組、模型組和黨參高劑量組小鼠腎組織總RNA，其純度符合正常范圍值（OD260/OD280>1.9，OD260/OD230>2.0），濃度為1.057、1.194、0.951 μg/μL。RNA純化后質(zhì)檢結(jié)果見(jiàn)圖1，28 s、18 s和5 s條帶較清晰，總RNA純度和質(zhì)量較好，適宜進(jìn)行miRNA表達(dá)譜檢測(cè)。

通過(guò)芯片檢測(cè)，每個(gè)樣本分別檢測(cè)到1909個(gè)小鼠miRNA探針信號(hào)值，將所檢測(cè)到的數(shù)據(jù)做聚類分析，發(fā)現(xiàn)模型組和正常組miRNA表達(dá)譜被明顯分開(kāi)，而黨參高劑量組與正常組miRNA表達(dá)譜聚類在一起。芯片結(jié)果顯示，一些在模型組比正常組中表達(dá)上調(diào)的miRNA，在黨參干預(yù)后表達(dá)明顯下調(diào)；而其中表達(dá)下調(diào)的miRNA，在黨參干預(yù)后表達(dá)明顯上調(diào)。見(jiàn)表2、圖2。

4.3 黨參對(duì)模型小鼠腎組織miRNA靶基因信號(hào)通路的影響

利用Argonaute數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)模型組比正常組中有36個(gè)差異表達(dá)miRNA與89個(gè)基因存在潛在的調(diào)控關(guān)系，通過(guò)MAS分析工具，發(fā)現(xiàn)這些miRNA靶基因參與到45條KEGG信號(hào)通路中（P<0.001），根據(jù)P值排序，將前20條信號(hào)通路整理，見(jiàn)表3。根據(jù)KEGG功能分類[5]，這些顯著富集的信號(hào)通路可歸為10個(gè)功能類別，見(jiàn)圖3。分析黨參高劑量組比模型組差異表達(dá)miRNA靶基因的信號(hào)通路，其結(jié)果與模型組比正常組的分析結(jié)果完全重合。

5 討論

本研究從miRNA入手，研究這一過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化及其所涉及的調(diào)控關(guān)系。芯片聚類結(jié)果顯示，黨參的確干預(yù)了D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老。而且，模型組比正常組中大多數(shù)差異表達(dá)miRNA，在黨參干預(yù)后表達(dá)模式發(fā)生了相反的調(diào)控變化。其中發(fā)生表達(dá)調(diào)控變化的miRNA有miR-494、miR-29b、miR-203、miR423、miR-125a、miR-466f和miR-138等，這些miRNA可能是黨參干預(yù)衰老過(guò)程的潛在靶點(diǎn)，在該過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。

利用Argonaute數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA的靶基因都是調(diào)控個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要分子，如miR-205和PTEN/SATB2/Runx2，miR-494和FGFR2/LIF，miR203和E2F3，miR466和PROX1。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析，miRNA靶基因參與的通路可劃分為不同的生物學(xué)功能類別。其中，腫瘤、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)，以及細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡等生物功能在所有分析結(jié)果中占主要比例。而且，有趣的是黨參高劑量組比模型組和模型組比正常組的功能分析結(jié)果完全一致。這說(shuō)明在黨參抗衰老過(guò)程中，miRNA與靶基因的調(diào)控關(guān)系和其功能環(huán)境密切聯(lián)系，即當(dāng)一個(gè)miRNA的表達(dá)被上調(diào)（或下調(diào)），其所調(diào)控靶基因的表達(dá)就會(huì)下調(diào)（或上調(diào)），該基因所參與的功能信號(hào)通路也受到調(diào)控。因此，在抗衰老過(guò)程中，黨參不僅影響miRNA表達(dá)譜的變化，也影響其作用的功能環(huán)境。

綜上，本研究利用高通量表達(dá)譜篩選了與D-半乳糖致小鼠衰老和黨參水提物抗衰老相關(guān)的差異表達(dá)miRNA，并結(jié)合生物信息學(xué)工具分析了miRNA在此過(guò)程中參與調(diào)控的生物學(xué)功能，為揭示黨參抗衰老機(jī)制提供了重要資料。

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