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原位預處理甘蔗糖蜜對耐高溫釀酒酵母突變株Saccharomyces cerevisiae AQ生產(chǎn)乙醇的影響*

0引言

【研究意義】在當今世界能源緊缺的情況下，不僅篩選耐高溫、產(chǎn)乙醇性能好的釀酒酵母菌株是必要的，還需要開發(fā)能加快乙醇發(fā)酵速率、縮短生產(chǎn)周期、提高乙醇收率等特點的綠色工藝?！厩叭搜芯窟M展】糖蜜是蔗糖生產(chǎn)的副產(chǎn)物，在我國廣西、云南和廣東等主要蔗糖產(chǎn)區(qū)已經(jīng)成為生物乙醇的主要生產(chǎn)原料[1]。釀酒酵母是糖蜜乙醇生產(chǎn)的主要出發(fā)菌株，最佳培養(yǎng)溫度多在25～35℃，這使得在目前的釀酒酵母乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中往往需要加入冷卻工序[2-3]。若既能保證乙醇產(chǎn)量，又能將發(fā)酵溫度提高至38～40℃，將可以極大地節(jié)省能源，并在我國夏季高溫季節(jié)仍能進行正常的乙醇發(fā)酵[4]。另一方面，糖蜜成分復雜且黏度高，培養(yǎng)基中的高濃度糖蜜會減弱發(fā)酵過程的傳質(zhì)和傳熱作用，從而抑制微生物菌株正常的生理代謝，降低細胞活力，導致乙醇產(chǎn)量偏低[5-7]。對糖蜜進行脫毒預處理，可以去除或降低其中對微生物生長產(chǎn)生抑制作用的有害物質(zhì)，從而增加目標產(chǎn)品的生產(chǎn)效率[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有預處理工藝需要對糖蜜原料進行稀釋、加熱、強酸/堿處理，工藝過程復雜且易產(chǎn)生環(huán)境污染。微生物細胞在預處理前后糖蜜中的生理特性差異也鮮有報道。因此，有必要探討和分析原位預處理糖蜜促進釀酒酵母生長和乙醇生產(chǎn)的原因，開發(fā)一條綠色、低成本糖蜜乙醇生產(chǎn)途徑。【擬解決的關鍵問題】以從窖泥中篩選的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae A及其突變株Saccharomyces cerevisiae AQ為出發(fā)菌株，考察在不同溫度和初糖濃度條件下，兩株菌的生長和乙醇生產(chǎn)性能差異，再以原位預處理前后糖蜜為發(fā)酵底物，測定突變株Saccharomyces cerevisiae AQ在不同培養(yǎng)基中的生長量、出芽率、乙醇產(chǎn)量，并通過細胞內(nèi)與呼吸作用相關酶的活力，即胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶、細胞質(zhì)內(nèi)ATP酶和線粒體內(nèi)ATP酶活力的變化,從機理上分析原位預處理對菌株生長和發(fā)酵過程的促進作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1甘蔗糖蜜

甘蔗糖蜜購于廣西南寧，含水分23.52%、總糖43.50%(其中葡萄糖3.69%、果糖8.91%、蔗糖30.90%)、灰分7.21%、總氮1.34%、膠體15.92%，其他8.51%。

甘蔗糖蜜原料在常溫下的黏度為10.3 Pa·s。經(jīng)復合表面活性劑/氨水二元復合體系[11]預處理后，在常溫下的黏度降低至2.3 Pa·s。

1.1.2菌株

Saccharomyces cerevisiae A為野生型釀酒酵母，從江蘇湯溝兩相和酒業(yè)有限公司窖泥中篩選獲得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號CCTCC AY 2015007。將Saccharomyces cerevisiae A進行紫外誘變，篩選得到最優(yōu)突變株Saccharomyces cerevisiae AQ，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號CCTCC AY 2015008。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母菌種子培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基，W/V)：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，自然pH值；在115℃條件下滅菌15 min；固體培養(yǎng)基添加2.5%瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基(W/V)：總糖20%(以糖蜜或葡萄糖為唯一碳源)，蛋白胨2%，磷酸氫二銨0.05%，尿素0.05%，磷酸氫二鉀0.02%，硫酸鎂0.02%，pH值為6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1種子培養(yǎng)

挑取保存在斜面培養(yǎng)基的菌種到YPD液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/500 mL三角瓶，37℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，作為種子液備用。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)

種子液以10%(V/V)的接種量添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.0,培養(yǎng)基裝液量為150 mL/500 mL三角瓶，30～37℃，200 r/min發(fā)酵36 h，再靜置發(fā)酵至終點。

1.2.2.1溫度對乙醇發(fā)酵的影響

以糖蜜原料為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一碳源，初始總糖濃度為100 g/L，發(fā)酵溫度分別為30℃、37℃和42℃，測定發(fā)酵34 h后Saccharomyces cerevisiae A和Saccharomyces cerevisiae AQ的菌體生長量(OD600)和出芽率，以及發(fā)酵液中的乙醇濃度，考察溫度對兩株釀酒酵母的生長及乙醇發(fā)酵的影響。

1.2.2.2初始糖濃度對乙醇發(fā)酵的影響

以糖蜜原料為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一碳源，發(fā)酵溫度為37℃，初始糖濃度分別為100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L和300 g/L，測定發(fā)酵34 h后Saccharomyces cerevisiae A和Saccharomyces cerevisiae AQ的菌體生長量(OD600)和出芽率，以及發(fā)酵液中的乙醇濃度，考察初始糖濃度對兩株釀酒酵母的生長及乙醇發(fā)酵的影響。

1.2.2.3預處理糖蜜對乙醇發(fā)酵及胞內(nèi)呼吸作用相關酶活力的影響

根據(jù)上述實驗結果選取最優(yōu)的發(fā)酵菌株，分別以葡萄糖、糖蜜原料、預處理糖蜜為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一碳源，初始總糖濃度為200 g/L，發(fā)酵溫度為37℃，每隔4～8 h取樣測定發(fā)酵液中的乙醇濃度，以及釀酒酵母菌體生長量(OD600)、胞內(nèi)SOD活力、胞內(nèi)過氧化物酶、細胞質(zhì)內(nèi)ATP酶和線粒體ATP酶活力，考察預處理對發(fā)酵菌株乙醇生產(chǎn)、菌體生長及胞內(nèi)呼吸作用相關酶活力的影響。

1.2.3分析

用生物傳感儀(SBA-40C型，山東微生物研究所)測定發(fā)酵液中乙醇濃度。

用紫外分光光度計(752s型，上海棱光技術有限公司)測定發(fā)酵液中釀酒酵母OD600。用血球計數(shù)板測定發(fā)酵過程中的釀酒酵母菌體數(shù)目并計算細胞出芽率。

釀酒酵母蛋白含量測定使用BCA(Bicinchoninic Acid)蛋白定量試劑盒，購自Sigma-Aldrich；胞內(nèi)SOD活力的測定使用SOD活力分析試劑盒，購自BioVision。試劑盒的使用均按說明書進行。胞內(nèi)過氧化物酶和ATP酶活力分別按照惠永華等[12]和Korshunov 等[13]報道的方法進行，其中線粒體的提取方法按張鳳蓮[14]報道的方法操作。

2結果與分析

2.1溫度對乙醇發(fā)酵的影響

在溫度分別為30℃，37℃和42℃時發(fā)酵34 h后，原始菌株Saccharomyces cerevisiae A的OD600分別為13.15，11.64和7.16，菌株生長量隨著發(fā)酵溫度的升高而降低；而突變株Saccharomyces cerevisiae AQ的OD600分別為13.75，13.12和10.66，當發(fā)酵溫度在30～37℃時，菌體生長量無顯著變化，當溫度升高至42℃時，生長量降低22.47%(圖1a)。兩株釀酒酵母在出芽率和乙醇生產(chǎn)上也出現(xiàn)類似的情況：Saccharomyces cerevisiae A的發(fā)酵溫度從30℃提高至37℃時，出芽率為20.92%，降低了13.99%(圖1b)，乙醇生產(chǎn)量為4.07%，降低了15.99%(圖1c)，當溫度提高至42℃時，出芽率和發(fā)酵液中乙醇濃度僅分別為15.33%和2.55%；而突變株Saccharomyces cerevisiae AQ的發(fā)酵溫度從30℃提高至37℃時，出芽率和乙醇生產(chǎn)量無顯著變化，將溫度進一步提高至42℃時，出芽率和發(fā)酵液中乙醇濃度才分別降低至19.22%和4.13%(圖1b、圖1c)。說明相對于原始菌株Saccharomyces cerevisiae A，突變株Saccharomyces cerevisiae AQ在30～37℃的發(fā)酵溫度下具備更好的生長量和乙醇生產(chǎn)穩(wěn)定性。

2.2初始糖濃度對乙醇發(fā)酵的影響

從圖2可以看出，當初始糖濃度為100 g/L時，兩株釀酒酵母的OD600、出芽率和發(fā)酵液乙醇濃度都無明顯差別，而當初始糖濃度進一步增加時，原始菌株Saccharomyces cerevisiae A的生長和乙醇生產(chǎn)受到明顯抑制。突變株Saccharomyces cerevisiae AQ在初始糖濃度為200 g/L時獲得最高的OD600、出芽率和乙醇濃度，分別為16.88，9.62%和6.84%。此條件下得到的乙醇收率為22.80%，而葡萄糖生產(chǎn)乙醇的理論收率為51.1%，故該條件下糖蜜原料生產(chǎn)乙醇的收率僅為理論收率的44.62%。

■:Saccharomyces cerevisiae A；□:Saccharomyces cerevisiae AQ

圖1溫度對菌株生長和乙醇生產(chǎn)的影響

Fig.1The effect of temperature on cell growth and ethanol production of Saccharomyces cerevisiae

結合2.1節(jié)的分析可知，突變株Saccharomyces cerevisiae AQ較原始菌株Saccharomyces cerevisiae A更適用于糖蜜發(fā)酵乙醇體系，因此選取突變株Saccharomyces cerevisiae AQ進行后續(xù)研究。

—□—:Saccharomyces cerevisiae A；

—△—:Saccharomyces cerevisiae AQ

圖2初始糖濃度對菌株生長和乙醇生產(chǎn)的影響

Fig.2The effect of initial sugar concentration on cell growth and ethanol production of Saccharomyces cerevisiae

2.3預處理對乙醇發(fā)酵的影響

由圖3可知，Saccharomyces cerevisiae AQ在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長速度最快，發(fā)酵34 h后OD600達到26.66，發(fā)酵液中的乙醇濃度為12.14%，表明葡萄糖仍是Saccharomyces cerevisiae AQ生長和乙醇生產(chǎn)的最佳碳源。Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜原料培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h的OD600僅有16.80，發(fā)酵液中的乙醇濃度僅為6.84%。而將預處理糖蜜作為唯一碳源時，發(fā)酵43 h的OD600為20.98，比糖蜜原料獲得的OD600值高24.88%；發(fā)酵液中乙醇濃度為9.32%，乙醇收率為31.07%，該收率為理論收率的60.80%，較糖蜜原料培養(yǎng)時提高36.26%。

2.4預處理對胞內(nèi)呼吸作用相關酶活力的影響

如圖4所示，Saccharomyces cerevisiae AQ分別在以葡萄糖、糖蜜原料和預處理糖蜜為唯一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵34 h后，其細胞內(nèi)SOD酶活力分別為10.45 U/mg蛋白、2.18 U/mg蛋白和7.66 U/mg蛋白；胞內(nèi)過氧化物酶活力分別為0.36 U/mg蛋白、0.12 U/mg蛋白和0.23 U/mg蛋白；細胞質(zhì)內(nèi)ATP酶活力分別為0.26 U/mg蛋白、0.05 U/mg蛋白和0.14 U/mg蛋白，線粒體內(nèi)ATP酶活力分別為0.42 U/mg蛋白、0.11 U/mg蛋白和0.27 U/mg蛋白。以預處理糖蜜作為唯一碳源，Saccharomyces cerevisiae AQ的胞內(nèi)SOD酶活力、胞內(nèi)過氧化物酶活力、細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)獲得的ATP酶活力較以糖蜜原料為唯一碳源時分別增加2.51倍、1.92倍、1.80倍和1.45倍。

—□—:葡萄糖Glucose；—△—:甘蔗糖蜜原料Molasses material；—◇—:預處理甘蔗糖蜜Pretreated molasses

圖3預處理對生長和乙醇生產(chǎn)的影響

Fig.3The effect of pretreatment on cell growth and ethanol production of Saccharomyces cerevisiae

圖4預處理對菌株胞內(nèi)酶活力的影響

Fig.4The effect of pretreatment on intracellular enzyme activity of Saccharomyces cerevisiae

3討論

篩選糖蜜乙醇生產(chǎn)性能良好的菌株，以及綠色簡便的糖蜜預處理方法是提高糖蜜乙醇生產(chǎn)的關鍵技術。本研究以廣西產(chǎn)甘蔗糖蜜為原料，探討原位預處理方法對釀酒酵母高溫發(fā)酵糖蜜乙醇的促進作用，以及在以原位預處理前后的甘蔗糖蜜為唯一碳源的培養(yǎng)基中，釀酒酵母突變株Saccharomyces cerevisiae AQ的生理特性變化。研究表明，突變株Saccharomyces cerevisiae AQ在37℃條件下仍能保持良好的糖蜜乙醇發(fā)酵能力。原位預處理方法將糖蜜黏度降低了77.67%，以該預處理糖蜜作為Saccharomyces cerevisiae AQ發(fā)酵過程的唯一碳源，乙醇收率為31.07%，較糖蜜原料提高36.26%。相對于其他糖蜜預處理方法而言，原位預處理同樣可以極大地促進菌體生長和乙醇生產(chǎn)，還具有工藝簡便、成本低、對環(huán)境友好等優(yōu)點。

在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)SOD、過氧化物酶，以及ATP酶活力與釀酒酵母在受到高鹽、高濃度乙醇、高糖等脅迫時的菌體活力呈正相關[15]。本研究中當以原位預處理糖蜜作為Saccharomyces cerevisiae AQ唯一碳源時，胞內(nèi)SOD酶、過氧化物酶、細胞質(zhì)內(nèi)ATP酶和線粒體內(nèi)ATP酶活力也較以糖蜜原料為唯一碳源時分別增加2.51倍，0.92倍，1.80倍和1.45倍，說明經(jīng)原位預處理獲得甘蔗糖蜜可通過增強Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜培養(yǎng)基中的呼吸作用，提高菌株活力，從而進一步提高乙醇收率。但原位預處理前后，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae AQ糖蜜乙醇生產(chǎn)過程中胞內(nèi)產(chǎn)物、胞內(nèi)酶活力的變化機理還需深入考察。

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(責任編輯：陸雁)

Promoting Ethanol Production of Cane Molasses by a Mutant Thermophilic Strain Saccharomyces cerevisiae AQ Using an in situ Pretreatment Method

何珣1，蔣學劍2**，花加偉1，陳可泉1***，柏建新1

HE Xun1，JIANG Xuejian2，HUA Jiawei1，CHEN Kequan1，BO Jianxin1

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京211816；2.江蘇湯溝兩相和酒業(yè)有限公司，江蘇連云港222535)

(1.State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical，Nanjing Tech University，Nanjing，Jiangsu，211816，China；2.Tanggou Liangxianghe Wine Pty Ltd.，Lianyungang，Jiangsu，222535，China)

摘要：【目的】探討和分析原位預處理糖蜜促進釀酒酵母生長和乙醇生產(chǎn)的原因，開發(fā)一條綠色、低成本糖蜜乙醇生產(chǎn)途徑?！痉椒ā肯仍诓煌瑴囟群统跏继菨舛葪l件下，考察釀酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae A及其突變株Saccharomyces cerevisiae AQ的生長和乙醇生產(chǎn)性能差異，再以原位預處理前后糖蜜為發(fā)酵底物，測定突變株Saccharomyces cerevisiae AQ在不同培養(yǎng)基中的生長量、出芽率、乙醇產(chǎn)量、胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶、細胞質(zhì)內(nèi)ATP酶和線粒體內(nèi)ATP酶活力，研究原位預處理糖蜜對其生理特性的影響?！窘Y果】在高溫發(fā)酵糖蜜過程中，突變株Saccharomyces cerevisiae AQ較原始菌株Saccharomyces cerevisiae A表現(xiàn)出更好的生長和乙醇發(fā)酵穩(wěn)定性。當以原位預處理糖蜜作為Saccharomyces cerevisiae AQ唯一碳源時，其胞內(nèi)SOD酶、過氧化物酶、細胞質(zhì)內(nèi)ATP酶和線粒體內(nèi)ATP酶活力較以糖蜜原料為唯一碳源時分別提高2.51倍，0.92倍，1.80倍和1.45倍，乙醇收率為31.07%，較以糖蜜原料為唯一碳源時提高36.26%?！窘Y論】突變株Saccharomyces cerevisiae AQ較原始菌株Saccharomyces cerevisiae A更適用于糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇體系，且新型的原位預處理方法能通過增強Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜培養(yǎng)基中的呼吸作用，提高菌株活力，從而進一步提高乙醇收率。

關鍵詞：原位預處理糖蜜釀酒酵母乙醇

Abstract：【Objective】The positive effects of the in situ pretreated molasses on Saccharomyces cerevisiae cell growth and ethanol production were explored and analyzed in order to develop a green and low cost pathway of ethanol production from molasses.【Methods】First, the differences of growth and ethanol production performance were compared between the original strain Saccharomyces cerevisiae A and the mutant strains Saccharomyces cerevisiae AQ;then both un-treated and in situ pretreated molasses were used as fermentation substrate,in which different parameters of the mutant strain Saccharomyces cerevisiae AQ were measured,including the cell growth,budding rate,ethanol production,and the activity of intracellular superoxide dismutase (SOD),peroxidase,ATP enzyme in the cytoplasm and the mitochondria,to investigate the effects of the in situ pretreatment molasses on the physiological characteristics of Saccharomyces cerevisiae AQ.【Results】During the fermentation process of molasses under high temperature condition,the mutant strain Saccharomyces cerevisiae AQ presented better stability in cell growth and ethanol yield than its original strain Saccharomyces cerevisiae A.When the in situ pretreated molasses was used as the single carbon source of Saccharomyces cerevisiae AQ,the activities of intracellular SOD enzyme,peroxidase,ATP enzyme in the cytoplasm and ATP enzyme in the mitochondria increased by 2.51,0.92,1.80,and 1.45 times, respectively,than that obtained in raw molasses material medium.The obtained ethanol yield from pretreated molasses was 31.07%,which was 36.26% higher than the ethanol yield obtained from molasses raw material.【Conclusion】The mutant strain Saccharomyces cerevisiae AQ was more suitable for molasses ethanol fermentation system than its original strain Saccharomyces cerevisiae A,and the new in situ pretreatment method could further increase ethanol yield through enhancing Saccharomyces cerevisiae AQ respiration and cell vitality in molasses mediums.

Key words:in situ pretreatment，molasses，Saccharomyces cerevisiae，ethanol

中圖分類號：TQ922.9

文獻標識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)01-0001-06

作者簡介：何珣(1983-)，女，實驗師，主要從事廢棄生物質(zhì)資源化和能源化研究。

收稿日期：2016-02-16

*國家“863”項目(2015AA021005)和廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(桂科重1598004-4)資助。

**共同第一作者：蔣學劍(1984-)，男，工程師，主要從事白酒生產(chǎn)工藝研究。

***通訊作者：陳可泉(1982-)，男，副研究員，碩士生導師，主要從事生物技術及酶催化研究，E-mail:kqchen@njtech.edu.cn。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(1):1～6

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-15

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.006.html