趙艷龍，詹儒林，張燕梅，何衍彪，常金梅，柳鳳，楊玉梅，周文釗(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江524091)

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煙草疫霉菌游動孢子接種劍麻方法研究

趙艷龍，詹儒林，張燕梅，何衍彪，常金梅，柳鳳，楊玉梅，周文釗*
(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江524091)

摘要:為更準(zhǔn)確鑒定劍麻對斑馬紋病的抗病性，以不同的培養(yǎng)方法對劍麻斑馬紋病病原菌－煙草疫霉菌產(chǎn)孢的效果進行了比較，并研究了游動孢子接種劍麻斑馬紋病的方法。試驗結(jié)果表明:菌絲塊－水培法產(chǎn)生孢子囊及游動孢子，速度最快，數(shù)量最多，且方法簡單，是最佳的培養(yǎng)方法;刺傷－棉花保濕法接種劍麻葉片，操作簡單方便，接種成功率高，是利用游動孢子接種劍麻斑馬紋病的最好方法。

關(guān)鍵詞:煙草疫霉菌;游動孢子;接種;劍麻

劍麻斑馬紋病是上世紀(jì)70年代開始在我國劍麻園發(fā)現(xiàn)，給劍麻生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失［1］，其病原菌主要是煙草疫霉菌( Phytophthora nicotianae van Breda de Haan)，該菌通過產(chǎn)生厚垣孢子及卵孢子，可以土壤中存活多年，因此，斑馬紋病一直以來都是影響劍麻生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一［2－4］。目前劍麻品種的斑馬紋病抗性鑒定常采用菌塊接種［5］，該方法操作雖然比較簡單，但準(zhǔn)確性不夠高。游動孢子可以測定濃度，因而利用游動孢子接種，可明顯提高抗病性鑒定的精確性，本文對煙草疫霉菌游動孢子的產(chǎn)生和接種方法進行了系統(tǒng)的研究，為劍麻抗病性及生理小種精準(zhǔn)鑒定提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

2014年9月從廣東湛江農(nóng)墾東方紅農(nóng)場農(nóng)科所劍麻園里采集劍麻斑馬紋病典型病斑的葉片，分離的病原菌經(jīng)柯赫氏法則證實并經(jīng)鑒定為煙草疫霉菌后，純化并保存。該菌種編號為DFHJB1 －2014。

1.1.2培養(yǎng)基制備

10% V8培養(yǎng)基: 10 mL V8汁加去離子水90 mL，CaCO30.02 g，瓊脂2 g。

1.1.3培養(yǎng)液制備

①土壤浸出液:取肥沃菜園表土500 g，加入去離子水500 mL，充分?jǐn)噭蚝箪o置數(shù)小時。土壤上清液用普通濾紙過濾后，再經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾2次除菌。置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?

②土壤溶液:取肥沃菜園土50 g加自來水200 mL，攪拌均勻，靜置數(shù)小時。上清液用普通濾紙過濾，濾過液即為土壤溶液;

③10% V8培養(yǎng)液: 100 mL V8汁加入CaCO31 g，在1500轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘。上清液與去離子水按1: 9比例稀釋;

④皮氏液配方: Ca( NO3)20.4 g，KH2PO40.15 g，Mg( NO3)20.15 g，CaCl20.06 g，蒸餾水1000 mL。在121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。

1.2試驗方法

1.2.1產(chǎn)生游動孢子試驗

將DFHJB1－2014接種于10% V8培養(yǎng)基平板，置于28℃半光照(即12 h光照和12 h黑暗交替)培養(yǎng)，4 d后用4 mm打孔器在菌絲邊緣打下菌餅，參照鄭小波［6］的方法，略作改動，分別按如下方法進行處理:

1)菌絲叢－水培法

將10% V8培養(yǎng)液倒入6 cm的培養(yǎng)皿中，每皿5 mL，取菌餅4塊移入培養(yǎng)皿，在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)1 d，傾去培養(yǎng)液，加入5 mL滅菌水重新懸浮菌絲叢，每皿滴加經(jīng)過濾除菌的土壤浸出液3滴，置于28℃、黑暗條件下培養(yǎng)，24 h后換一次水并滴加土壤浸出液。

2)菌絲塊－水培法

在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中加入5 mL滅菌水，取菌餅4塊置于滅菌水中，菌絲面朝上，讓滅菌水剛剛淹過菌絲面。置日光燈下連續(xù)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃。

3)皮氏培養(yǎng)液法

將菌餅4塊移入裝有5 mL皮氏溶液的培養(yǎng)皿中，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4 d，傾去皮氏溶液，換上滅菌水，置于28℃培養(yǎng)。

4)菌絲塊－土壤溶液法

在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中加入5 mL土壤溶液，取菌餅4塊置于土壤溶液中，菌絲面朝上，使土壤溶液剛剛漫過菌絲塊。置光照下28℃培養(yǎng)。

以上各處理1 d、2 d、3 d和6 d后分別觀察孢子囊和游動孢子的產(chǎn)生情況，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)2個培養(yǎng)皿。孢子囊和游動孢子的觀察測定分別按照陳方新［7］的方法，并使用血球計數(shù)板對游動孢子進行計數(shù)。

1.2.2接種方法試驗

1.2.2.1接種材料準(zhǔn)備

以盆栽法培育劍麻苗至20片葉片時，割取下部無病蟲害、無損傷的葉片，每株3片，共割取42片作接種材料。

1.2.2.2接種體準(zhǔn)備

用菌絲塊水培法培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察，產(chǎn)生大量游動孢子后，吸取孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)并配制成濃度為1×104個/mL的孢子懸浮液，作接種體。

1.2.2.3接種方法

1)刺傷－棉花保濕法: 75%酒精消毒后，6根大頭針刺傷葉片表面，用移液槍滴50 μL游動孢子懸浮液于傷口上，棉花保濕，置于28℃條件下培養(yǎng)。

2)刺傷－磁盤保濕法: 75%酒精消毒后，6根大頭針刺傷葉片表面，用移液槍滴50 μL游動孢子懸浮液于傷口上，小心放入磁盤中密封保濕，置于28℃條件下培養(yǎng)。

3)刺傷接種法: 75%酒精消毒后，6根大頭針刺傷葉片表面，用移液槍滴50 μL游動孢子懸浮液于傷口上，小心放入磁盤中密封，置于28℃條件下培養(yǎng)。

4)注射－棉花保濕法: 75%酒精消毒后，用微量進樣器注射10 μL游動孢子懸浮液，棉花保濕，置于28℃條件下培養(yǎng)。

5)注射－磁盤保濕法: 75%酒精消毒后，用微量進樣器注射10 μL游動孢子懸浮液，小心放入磁盤中密封保濕，置于28℃條件下培養(yǎng)。

6)注射接種法: 75%酒精消毒后，用微量進樣器注射10 μL游動孢子懸浮液，小心放入磁盤中密封，置于28℃條件下培養(yǎng)。

每片葉片在上、中、下各接一個點。每方法接種2張葉片，3次重復(fù)。

7)噴霧法: 75%酒精消毒后，將游動孢子懸浮液噴霧至整個葉片表面上，小心放入磁盤中密封保濕，置于28℃條件下培養(yǎng)。該方法接種2片葉片，3次重復(fù)。

1.2.2.4發(fā)病情況觀察

接種后6 d，觀察、記錄各接種方法接種點是否發(fā)病，并計算發(fā)病率。

2　結(jié)果與分析

2.1游動孢子產(chǎn)生試驗結(jié)果

通過鏡檢，煙草疫霉菌產(chǎn)生的孢子囊成熟以后，即逐漸釋放游動孢子(圖1)。

圖1　煙草疫霉菌游動孢子及其釋放Fig.1　 Zoosproes of phytophthora nicotianae and its realease

不同培養(yǎng)方法產(chǎn)生的孢子囊及游動孢子結(jié)果見表1:

表1　不同培養(yǎng)方法對產(chǎn)孢的影響Tab.1　 The influence of different cultivation methods on the spore production

從表1可見:菌絲塊水培法產(chǎn)孢最快最多，1 d后孢子囊濃度即達到2.28×103個/mL，且孢子囊釋放產(chǎn)生大量游動孢子(濃度為26.08×103個/mL)，2 d后孢子囊濃度1.75×103個/mL，伴隨著較多的游動孢子(濃度為8.87×103個/mL)，說明其一邊繼續(xù)產(chǎn)生孢子囊，一邊釋放游動孢子，3 d后孢子囊還有0.60×103個/mL，游動孢子濃度為3.05×103個/mL，6 d后既沒有孢子囊，也沒有游動孢子，說明前幾天產(chǎn)生的孢子囊已全部釋放完;其次是菌絲塊－土壤溶液法，1 d后孢子囊濃度達到1.27×103個/mL，2 d后為0.82×103個/mL，3 d后為0.85×103個/mL，1 d后產(chǎn)生大量游動孢子(濃度為16.17×103個/mL)，2 d、3 d后還有較多的游動孢子，說明該培養(yǎng)方法產(chǎn)孢和釋放游動孢子速度都要慢些，但6 d后也已釋放完畢;皮氏培養(yǎng)液法1 d后孢子囊濃度達0.58×103個/ mL，釋放的游動孢子較前2種方法少(濃度為3.23×103個/mL)，3 d后孢子囊比較少，為0.34× 103個/mL，但6 d后又產(chǎn)生大量孢子囊(濃度達2.61×103個/mL)和游動孢子(濃度20.12×103個/mL)，說明該培養(yǎng)方法在經(jīng)過一段速度較慢的產(chǎn)孢過程后，其營養(yǎng)供應(yīng)時間長，致6 d后仍能產(chǎn)生孢子囊及游動孢子;菌絲叢水培法最慢，到6 d后才產(chǎn)生孢子囊和少量游動孢子，是因為前幾天一直在長菌絲，孢子囊剛剛開始釋放。

綜合上述結(jié)果，用菌絲塊水培法產(chǎn)生孢子囊及游動孢子，速度最快，數(shù)量最多，且方法簡單，它不需要其它培養(yǎng)液，也不需要復(fù)雜的操作;菌絲塊土壤溶液法，產(chǎn)孢子囊速度快，數(shù)量也較多，游動孢子釋放多，持續(xù)時間長，但需要加其它培養(yǎng)液，且操作較復(fù)雜;皮氏培養(yǎng)液法，產(chǎn)生孢子囊速度快，但數(shù)量較少，游動孢子數(shù)少;而菌絲叢水培法，可以產(chǎn)生孢子囊及游動孢子，但速度太慢，因此，菌絲塊水培法是最佳的培養(yǎng)方法。

2.2接種方法試驗結(jié)果

各接種方法的發(fā)病情況及發(fā)病率見表2:

表2　不同接種方法對劍麻葉片發(fā)病情況的影響Tab.2　 Effects of different inoculation methods on disease development of sisal leaves

從表2可見:刺傷－棉花保濕法接種的成功率最高，發(fā)病率為100%，注射－棉花保濕法成功率次之，其發(fā)病率為77.8%，刺傷－磁盤保濕法、刺傷接種法、注射－磁盤保濕法和注射接種法成功率稍低，其發(fā)病率為72.2%，而噴霧法接種不成功，發(fā)病率為0。因此刺傷－棉花保濕法是最好的接種方法。

3　討論和結(jié)論

3.1關(guān)于孢子囊的產(chǎn)生和游動孢子的釋放

國內(nèi)外對于產(chǎn)孢方法有不少研究［6－14］，王萬能［8］挑取菌絲在0.1% KNO3培養(yǎng)，6 d后產(chǎn)生孢子囊和游動孢子;徐敬友［9］挑取菌絲塊于皮氏液培養(yǎng)，誘發(fā)產(chǎn)生孢子囊;鄭小波［6］、沈會芳［10］、楊建卿［11］、朱賢朝［12］、王智發(fā)［13］等將產(chǎn)生大量成熟的孢子囊利用低溫刺激，孢子囊即釋放游動孢子，但都要培養(yǎng)較長時間，使其產(chǎn)生成熟的孢子囊才能產(chǎn)生游動孢子，本試驗篩選出菌絲塊水培法，即將該菌在10% V8平板培養(yǎng)4 d，再以滅菌水浸泡從平板挑取的菌塊，光照培養(yǎng)1 d即可產(chǎn)生大量游動孢子囊并釋放大量游動孢子。本方法操作簡單，不需要低溫刺激，從培養(yǎng)到產(chǎn)孢所需時間短，游動孢子產(chǎn)生快而多，是一種較為簡便快捷的方法。

3.2關(guān)于游動孢子接種劍麻的方法

不同的接種方法，接種效果有明顯差別，分析其原因是:首先，斑馬紋病菌無法通過蠟質(zhì)層進入氣孔，自然孔口無法發(fā)病，只有對葉片造成傷口，才可能使其直接進入葉片組織導(dǎo)致發(fā)病，因此，噴霧法接種不成功，而刺傷和注射接種可以成功;但造成傷口后也不一定就能發(fā)病，還必須具備一定的環(huán)境條件，溫度和濕度，斑馬紋病要求的濕度更高，因此，雖然都是刺傷接種，但棉花保濕接種法比磁盤保濕和刺傷接種法的發(fā)病率都高;另外，注射后進行接種，由于注射的深度不一致，假如造成的傷口太大，損壞了葉片組織，也有可能造成病菌無法感染，因此，盡管都用棉花保濕，刺傷接種的成功率比注射接種的成功率也要高。

利用游動孢子接種，前人以煙草和菠蘿為對象做過許多研究［8，10，12－13］，對于劍麻斑馬紋病的接種，前人都是用菌絲塊作為接種體［5，15］，而利用游動孢子作為接種體接種劍麻卻未見報道，本試驗嘗試多種方法，最后確定刺傷接種棉花保濕法為最佳的方法。此方法可以更加準(zhǔn)確的接種斑馬紋病，為生理小種鑒定和抗性鑒定提供依據(jù)。

本文利用劍麻離體葉片進行游動孢子接種，存在一定局限性，下一步將繼續(xù)試驗，進一步補充和完善劍麻活體葉片組織接種方法。

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Study on Inoculation Methods with Zoospore of Phytophthora nicotianae Breda on Sisal

ZHAO Yanlong，ZHAN Rulin，ZHANG Yanmei，HE Yanbiao，CHANG Jinmei，LIU Feng，YANG Yumei，ZHOU Wenzhao*
( South Subtropical Crops Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524091，Guangdong，China)

Abstract:In order to identify accurately the resistance to zebra disease of sisal，the effects of sporulation for Phytophthora nicotianae Breda by different culture method were compared，and the inoculation methods with zoospore were studied.Results showed that the method of Mycelia－h(huán)ydroponics was the best culture method for the simplest operation，together with the most production of sporangium and zoospore and the fastest sporulation rate．And wound inoculation－cotton mistrue retention was the best method of inoculation with zoospore of Phytophthora nicotianae Breda for the simple and convenient operation，and the highest successful rate of inoculation

Key words:Phytophthora nicotianae Breda;zoospore;inoculation;sisal

*通訊作者:周文釗( 1965－)，男，研究員，主要從事劍麻育種研究。E－mail: zwenzhao@163.com。

作者簡介:趙艷龍( 1968－)，男，高級農(nóng)藝師，主要從事熱帶作物病蟲害綜合防治。E－mail: zylyym@163.com。

基金項目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系( CARS－19－E03) ;國家自然科學(xué)基金( No:31401427)

收稿日期:2015－11－19

文章編號:1671－3532( 2016) 01－0019－05

中圖分類號:S563.8

文獻標(biāo)識碼:A