阿米娜·阿不拉，斯拉甫·艾白，古力娜·達(dá)吾提，李治建

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所毒理研究室，新疆烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療設(shè)備科，新疆烏魯木齊 830049）

鞣花酸體外抗真菌活性及對小鼠白色念珠菌感染模型的治療作用研究

阿米娜·阿不拉1，斯拉甫·艾白2，古力娜·達(dá)吾提3，李治建2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所毒理研究室，新疆烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療設(shè)備科，新疆烏魯木齊 830049）

目的 研究鞣花酸體內(nèi)外抗真菌作用，確定其抗真菌譜，評價其對小鼠白色念珠菌感染的治療作用。方法 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的《酵母菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》（M27-A），測定鞣花酸對臨床常見念珠菌的MIC值，確定其抗真菌譜，篩選出對其敏感的真菌菌株；采用小鼠腹腔注射白色念珠菌造成系統(tǒng)性真菌感染模型，以小鼠存活率、血清SOD和MDA含量、肝臟組織病理學(xué)為評價指標(biāo)，觀察鞣花酸的體內(nèi)抗真菌作用。結(jié)果 鞣花酸體外對念珠菌中白色念珠菌（C.albicans）最敏感，平均MIC為25.0 mg·L－1；與模型組比較，鞣花酸體內(nèi)可明顯改善造模小鼠的一般癥狀，使動物體重明顯增加（P＜0.05），高劑量組丙二醛（MDA）含量降低（P＜0.05），超氧化物歧化酶（SOD）活力增加（P＜0.01），肝臟組織病理學(xué)有明顯改善。結(jié)論 鞣花酸有明顯的體內(nèi)外抗真菌活性，具有一定開發(fā)利用價值。

鞣花酸；抗真菌；最低抑菌濃度；白色念珠菌；小鼠；丙二醛；超氧化物歧化酶

真菌感染或真菌病按照侵犯部位可分為淺部真菌病和深部真菌病，是一種常見病、多發(fā)病，近年來呈逐漸上升的趨勢，引起該病的病因比較復(fù)雜，當(dāng)人體免疫力低下時，淺部真菌感染還會導(dǎo)致深部真菌感染。深部真菌感染一般由念珠菌、隱球菌、曲霉菌等引起，雖不如淺部真菌感染發(fā)病多，但危害性大，如不及時治療可導(dǎo)致死亡［1］。鞣花酸（ellagic acid，EA）是一種沒食子酸二聚衍生的天然多酚，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、清除自由基等作用［2－9］，課題組從地錦草（Euphorbia humifusa Willd）中分離得到鞣花酸，地錦草是維吾爾醫(yī)經(jīng)典名方“夏塔熱方劑”中的君藥，抗皮膚真菌作用已十分明確，用于治療頭癬、體癬、足癬、花斑癬等疾病，療效顯著［10－11］。最近亦有國外學(xué)者報道，鞣花酸具有抗致病真菌、細(xì)菌作用［12］，但僅限于體外抑菌作用的觀察，未進(jìn)行抗真菌藥物敏感性試驗篩選和體內(nèi)抗真菌作用研究。本研究根據(jù)美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的《酵母菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》（M27-A）［12］，測定鞣花酸的最低抑菌濃度值（MIC）來考察其體外抗真菌活性，篩選出對其敏感的真菌菌株，進(jìn)一步建立白色念珠菌感染小鼠模型，探討鞣花酸對白色念珠菌感染動物的治療作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與實試劑 EA（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY13933）；氟康唑氯化鈉注射液（flu-conazole，F(xiàn)lu，河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號：B13070605）；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cyc，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：12091625）；三氮嗎啡琳丙磺酸（MOPS），美國Amresco公司，批號：0670；RPMI 1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉），Invitrogen公司，批號：31800-022；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），碧迪醫(yī)療器械有限公司，批號：2263097；總超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；二甲基亞砜（DMSO），天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號：20120330；氫氧化鈉，分析純，天津化學(xué)試劑三廠，批號：20120802；0.9％氯化鈉注射液，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：20121220。

1.2 菌種 光滑念珠菌（C.glabrata）1株，熱帶念珠菌（C.tropicalis）1株，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院提供；白色念珠菌（C.albicans，ATCC 90028）1株，購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。

1.3 動物 昆明種小鼠60只，♀♂各半，6周齡，體質(zhì)量（25±2）g左右，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCKK（新）2011-0001。

1.3 體外抗真菌試驗

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

1.3.1.1 RPMI1640培養(yǎng)基的配制 將34.5 g MOPS粉末和10.4 g RPMI1640粉末溶于900 mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，?.0 mol·L－1NaOH溶液調(diào)整其pH至7.0（25℃），加蒸餾水定容至1.0 L，濾過滅菌，存于4℃冰箱備用。

1.3.1.2 PDA培養(yǎng)基的配制 稱取PDA粉末38.0 g，加入1 000 mL蒸餾水中，搖勻，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20 min，分裝于無菌試管，4℃保存，備用。

1.3.2 菌種活化 將來自菌株挑取1～2個菌落，以劃線接種法接種于新制備的馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）試管斜面中央，36℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行藥敏實驗。

1.3.3 最低抑菌濃度值的測定 根據(jù)美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的《酵母菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》（M27-A）［13］，測定鞣花酸抗真菌的最低抑菌濃度值（MIC）。

1.3.3.1 抗真菌藥物儲備液、稀釋液的制備 稱取鞣花酸50.0 mg，用1 mL DMSO溶解，制成濃度為50 000 mg·L－1的儲備液，存于－70℃冰箱備用；吸取氟康唑氯化鈉注射液800 μL，加入3 200 μL RPMI1640培養(yǎng)液，制成濃度為400 mg·L－1的儲備液，存于－70℃冰箱備用。

臨用前將鞣花酸、氟康唑儲備液，分別用RPMI-1640培養(yǎng)基倍比稀釋成2倍試驗終濃度，鞣花酸、氟康唑的2倍終濃度由高向低依次為：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mg·L－1。

1.3.3.2 菌接種液的制備 將受試的念珠菌接種于PDA斜面上，36℃培養(yǎng)48 h。挑取1－2塊菌落，加入2 mL無菌的0.9％的NaCl溶液中，用0.5＃McFarland standard比濁管比濁，用RPMI1640液基稀釋100倍后，再稀釋至2倍終濃度。

1.3.3.3 接種與培養(yǎng) 將100 μL的2倍終濃度的藥液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并設(shè)真菌生長對照孔和空白對照孔；然后將調(diào)好的菌接種液100 μL，分別加入相應(yīng)的微孔內(nèi)。鞣花酸、氟康唑的試驗終濃度由高向低依次為：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813 mg·L－1。于36℃恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h讀結(jié)果。

1.4 對小鼠白色念珠菌感染模型的治療作用

1.4.1 試驗分組 昆明種小鼠60只，♀♂各半，6周齡，體質(zhì)量（25±2）g，每組12只，按體重、性別隨機(jī)分為5組。即空白組、模型組、陽性對照藥氟康唑組（Flu，80 mg·kg－1·d－1）、鞣花酸高劑量（80 mg ·kg－1·d－1）、鞣花酸低（40 mg·kg－1·d－1）劑量組。

1.4.2 動物模型的建立與給藥 白色念珠菌感染小鼠模型的建立［14－15］：小鼠造模前3 d腹腔注射100 mg·kg－1·d－1環(huán)磷酰胺（Cyc），d 4腹腔注射1 mL 0.4×109～5×109cfu·L－1白色念珠菌，造模后連續(xù)給藥7 d（Tab 1）。觀察各組小鼠一般狀況及死亡情況，每天記錄動物體重變化、存活時間，計算存活率。最后1次給藥結(jié)束24 h后，稱體重，計算死亡率。取血、離心10 min（4 000 r·min－1），按試劑盒操作測定血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。小鼠尸體全部澆乙醇火燒處理。

1.4.3 病理形態(tài)學(xué) 各組小鼠處死后，取各組相同部位肝小葉，10％甲醛溶液中固定72 h后，石蠟包埋，切片厚3 μm，進(jìn)行常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色后鏡檢。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間差別用以F檢驗表示。

2 結(jié)果

Tab 1 Model replication and administration method

2.1 體外抗真菌藥物敏感性試驗 鞣花酸對白色念珠菌（C.albicans）MIC值為25 mg·L－1、光滑念珠菌（C.glabrata）大于100 mg·L－1、熱帶念珠菌（C.tropicalis）為75 mg·L－1；氟康唑?qū).albicans平均MIC值為12.5 mg·L－1、C.glabrata為25 mg· L－1、C.tropicalis為25 mg·L－1（Tab 2）。

Tab 2 In vitro antifungal activity of ellagic acid（EA）against Candida species

2.2 對小鼠白色念珠菌感染模型的治療作用

2.2.1 一般觀察 正常對照組小鼠實驗過程中均較活潑，飲食正常，皮毛整齊。模型組接種白色念珠菌后d 2開始出現(xiàn)皮毛不整、無光澤，倦縮駝背，活動和進(jìn)食量減少，精神不振、體重下降等現(xiàn)象。陽性藥氟康唑組和鞣花酸高劑量組小鼠生長狀況給藥5 d后癥狀有所改善，氟康唑組小鼠狀況最為接近正常對照組，無死亡現(xiàn)象。與模型組比較，鞣花酸高劑量組小鼠體重有明顯升高（P＜0.01），鞣花酸低、高劑量組死亡率明顯低于模型組，但劑量關(guān)系不明顯（Tab 3）。

Tab 3 Effect of EA on death rate and weight in a Candida albicans infect mice model（±s，n＝12）

Tab 3 Effect of EA on death rate and weight in a Candida albicans infect mice model（±s，n＝12）

**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Group Death /n Death rate/％ Weight /g Control 0 0 30.99±0.72 Model 4 33.3 21.94±0.85**Fluconazole 80 mg·kg－1 0 0 25.57±0.90＃EA 80 mg·kg－1 2 16.7 26.02±1.10＃＃EA 40 mg·kg－11 8.3 23.47±0.82

2.2.2 SOD、MDA含量 正常組小鼠血清MDA含量與模型組比較有明顯降低（P＜0.01），鞣花酸高、低劑量組MDA含量與模型組比較均有降低，其中鞣花酸高劑量組較為明顯（P＜0.05），陽性藥氟康唑組MDA含量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中SOD均升高，其中鞣花酸高、低劑量組、氟康唑組SOD活性與模型組比較明顯升高（P＜0.01）（Tab 4）。

Tab 4 Effect of EA on activity of serum SOD，MDA in a Candida albicans infect mice model（±s，n＝12）

Tab 4 Effect of EA on activity of serum SOD，MDA in a Candida albicans infect mice model（±s，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Group MDA/μmol·L－1 SOD/kU·L －1 Control 7.90±0.18 180.98±2.87 Model 10.06±0.19* 67.68±3.68**Fluconazole 80 mg·kg－1 8.56±0.18＃＃ 172.38±1.64＃＃EA 80 mg·kg－1 9.07±0.09＃ 124.18±3.56＃＃EA 40 mg·kg－19.50±0.31 82.83±4.53

2.2.3 組織病理學(xué)變化 除空白對照組外，各組均具有一定程度的病變，模型組中肝組織結(jié)節(jié)狀壞死，灶內(nèi)肝細(xì)胞大量消失，被大量上皮樣細(xì)胞、大量炎癥細(xì)胞代替，可見造模較成功。陽性藥氟康唑組與鞣花酸高劑量組均為略微點狀壞死，肝細(xì)胞基本正常，表明炎癥較輕；鞣花酸低劑量組結(jié)節(jié)狀壞死，炎細(xì)胞浸潤。由組織病理學(xué)觀察，鞣花酸高劑量組與氟康唑組治療效果相當(dāng)，見Fig 1。

3 討論

Fig 1 Pathological changes of liver of each group after treatment（HE，×400）

隨著廣譜抗生素、腫瘤化療藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑在臨床的廣泛應(yīng)用、器官移植及導(dǎo)管技術(shù)的開展、艾滋病患者的不斷增多，免疫功能低下患者日益增加，致病真菌引起的深部感染已經(jīng)成為上述免疫功能低下患者的主要死亡原因之一，日益受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注［16］。另外，致病真菌對現(xiàn)有藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重，使得真菌感染易于發(fā)生并難于控制。因此，新型抗真菌藥物的研發(fā)受到越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用的抗真菌藥物在一定程度上和一定范圍內(nèi)起到了控制致病真菌感染的作用，但還存在許多缺點與不足，有一定副作用產(chǎn)生，如兩性霉素B有嚴(yán)重的腎毒性，氮唑類藥物存在嚴(yán)重的腎毒性與肝毒性［17］。因此，新型高效低毒抗真菌藥物的研發(fā)受到越來越多的關(guān)注。

國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，地錦草提取物和鞣花酸均有不同程度的抗真菌作用［10－12］。本試驗針對鞣花酸對3株臨床常見念珠菌的進(jìn)行了體外抗真菌作用研究，結(jié)果鞣花酸體外抗白色念珠菌活性較好；體內(nèi)鞣花酸高劑量組對小鼠白色念珠菌感染模型有明顯的治療作用，從動物死亡只數(shù)看，鞣花酸低、高劑量組分別死亡1只和2只，并無明顯差異，結(jié)合其MDA、SOD結(jié)果，鞣花酸高劑量組SOD活性與模型組比較明顯升高、MDA明顯降低，且組織病理學(xué)觀察鞣花酸高劑量組可使造模小鼠肝臟組織病理學(xué)明顯改善。因此，雖然鞣花酸低、高劑量組在動物死亡只數(shù)劑量關(guān)系不明顯，但結(jié)合各方面結(jié)果綜合分析，鞣花酸高劑量對造模小鼠的治療作用優(yōu)于低劑量組?？傊坊ㄋ狍w內(nèi)外抗白色念珠菌作用明顯。本研究為從天然藥物中尋找新型抗真菌先導(dǎo)化合物提供一定的實驗依據(jù)。

（致謝：本實驗在新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥理毒理實驗室完成，感謝實驗室老師的幫助。）

［1］ Odds F C.Pathogenesis of Candida infections［J］.Am Acad Der-matol，1994，31（suppl 3）：2－5.

［2］ Edderkaoui M，Odinokova I，Ohno I，et al.Ellagic acid induces ap-optosis through inhibition of nuclear factor κB in pancreatic cancer cells［J］.World J Gastroenterol，2008，14（23）：3672－80.

［3］ Liu N，Liu J T，Zhang Q Z.Ellagic acid-induced hypercoagulable state in animals：a potentially useful animal hypercoagulable model for evaluation of anticoagulants［J］.Chin Med Sci，2010，25（4）：237－42.

［4］ Panichayupakarananta P，Issuriyal A，Sirikatithaml A，Wang W.Antioxidant assay-guided purification and LC determination of el-lagic acid in pomegranate peel［J］.J Chromat Sci，2010，48（6）：456－9.

［5］ 韓鳳梅，張曉雷，陳 勇.齊墩果酸、鞣花酸與拉米夫定體外聯(lián)合抗HBV作用研究［J］.湖北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，31（4）：426－9.

［5］ Han F M，Zhang X L，Chen Y.The inhibitory action of lamivudi-ne combined with oleanolic acid or ellagic acid against hepatitis B virus in vitro［J］.J Hubei Univ（Nat Sci），2009，31（4）：426－9.

［6］ Soh P N，Witkowski B，Olagnier D，et al.In vitro and in vivo properties of ellagic acid in malaria treatment［J］.Antimicrob A-gents Chemother，2009，53（3）：1100－6.

［7］ Chatterjeel A，Chatterjeel S，Das S，et al.Ellagic acid facilitates indomethacin-induced gastric ulcer healing via COX-2 up-regula-tion［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2012，44（7）：565－76.

［8］ Aiyer H S，Gupta R C.Berries and ellagic acid prevent estrogen-induced mammary tumorigenesis by modulating enzymes of estrogen metabolism［J］.Cancer Prev Res，2010，3（6）：727－37.

［9］ 丁運生，孫小虎，李有桂，朱 凱.鞣花酸及其衍生物研究進(jìn)展［J］.合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，31（11）：1809－12.

［9］ Ding Y S，Sun X H，Li Y G，Zhu K.Recent progress of ellagic acid and its derivatives［J］.J Hefei Univ Technol，2008，31 （11）：1809－12.

［10］Li Z J，Guo X，Dawuti G，Aibai S.Antifungal activity of ellagic acid in vitro and in vivo［J］.Phytotherapy Res，2015，29（7）：1019－25.

［11］安慧霞，古麗娜·達(dá)吾提，李治建，斯拉甫·艾白.地錦草有效部位抗真菌作用及其機(jī)制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26 （9）：1162－5.

［11］An H X，Gulnar D，Li Z J，Silafu A.Active component of Eu-phorbia humifusa antifungal activity and mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（9）：1162－5.

［12］Bakkiyaraj D，Nandhini J R，Malathy B，Pandian S K.The anti-biofilm potential of pomegranate（Punica granatum L.）extract a-gainst human bacterial and fungal pathogens［J］.Biofouling，2013，29（8）：929－37.

［13］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts：Approved Standard M27-A2［P］.USA，2002.

［14］Fidel P L Jr，Barousse Y，Espinosa T，et al.An intravaginal live candida challenge in humans leads to new hypotheses for the im-munopathogenesis of vulvovaginal candidiasis［J］.Infeet Immun，2004，72（5）：2939－46.

［15］王建釗，王 英，顧 軍，等.深部克柔念珠菌感染脈鼠模型的建立及致病性初步研究［J］.臨床皮膚科雜志，2004，33（6）：331－3.

［15］Wang J Z，Wang Y，Gu J，et al.The establishment of guinea pig model infection with Candida krusei and preliminarily study［J］.J Clin Dermatol，2004，33（6）：331－3.

［16］Ruddock P S，Liao M，F(xiàn)oster B C，et al.Garlic natural health products exhibit variable constituent levels and antimicrobial activi-ty against Neisseria gonorrhoeae，Staphylococcus aureus and En-terococcus faecalis［J］.Phytother Res，2005，19（4）：327－34.

［17］Su F W，Perumalswami P，Grammer L C.Acute hepatitis and rash to fluconazole［J］.Allergy，2003，58（11）：1215－56.

Therapeutic effect of ellagic acid on Candida albicans infect mice models and its antifungal activity in vitro

ABULA·Amina1，AIBAI·Silafu2，DAWUTI·Gulnar3，LI Zhi-jian2（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine，Urumqi 830049，China；3.Uighur Medicine Hospital of Xinjiang Autonomous Region，Urumqi 830049，China）

Aim To investigate the inhibitory effect of ellagic acid（EA）on fungal strains both in vitro and in vivo.Methods The minimal inhibitory concentration （MIC）was determined by the NCCLS（M27-A2）standard method in vitro.The therapeutic action was studied using a Candida albicans infect mice model，the survival rate and the content of SOD，MDA in ser-um were measured，and the pathological changes of liver were observed under light microscope after HE staining.Results EA was active against three Candida strains，with MICs between 25.0 and 75.0 mg·L－1.The most sensitive Candida species was C.albicans （MIC＝25.0 mg·L－1）.It was inactive against Can- dida glabrata.An in vivo test demonstrated that intrap-eritoneal injection of EA（40 and 80 mg·kg－1）signif-icantly enhanced the pathological changes of liver，im-proved the symptom，increased the weight and the SOD activity，and decreased the MDA activity in a mice in-fection model of C.albicans.Conclusion Ellagic acid has the potential to be developed as a natural antifungal agent.

ellagic acid；antifungal activity；minimal inhibitory concentration；C.albicans；mice；MDA；SOD

時間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.040.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.020

A

1001－1978（2016）03－0399－05

R-332；R379.4；R519.305；R987.5

2015－11－13，

2015－12－23

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（No 201517112）

阿米娜·阿不拉（1989－），女，碩士生，研究方向：抗真菌藥理學(xué)，E-mail：285607384＠qq.com；李治建（1982－），男，碩士，副研究員，研究方向：藥理毒理學(xué)，通訊作者，E-mail：lizhijian0220＠sina.com；斯拉甫·艾白（1960－），男，碩士，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥理毒理學(xué)，通訊作者，E-mail：aibai＠263.net