標(biāo)記引物數(shù)量對(duì)白樺遺傳多樣性的影響

趙雙菁,劉瑩瑩,魏敏靜,楊傳平,魏志剛

〔林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040〕

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標(biāo)記引物數(shù)量對(duì)白樺遺傳多樣性的影響

趙雙菁,劉瑩瑩,魏敏靜,楊傳平,魏志剛

〔林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040〕

摘要以帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)15個(gè)種源的白樺種源試驗(yàn)林300個(gè)樣本為試驗(yàn)材料，通過(guò)不同數(shù)量的SRAP引物對(duì)白樺遺傳多樣性研究結(jié)果的影響做出分析，并提出標(biāo)記引物確定的計(jì)算公式。結(jié)果表明，SRAP引物數(shù)量不影響白樺各種源間遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)，但隨著引物數(shù)量的增加，區(qū)分不同種源間遺傳差異的能力隨之提高，當(dāng)SRAP引物數(shù)量為15對(duì)時(shí)，可探測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)98.5%以上。

關(guān)鍵詞白樺;標(biāo)記引物數(shù)量;遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)和核心，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)方面，保護(hù)生物多樣性最終是要保護(hù)其遺傳多樣性[1]。林木遺傳多樣性的研究開(kāi)始于形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的種源試驗(yàn)，如杉木(Cunninghamialanceolata)、桉樹(shù)(Eucalyptusrobusta)、紅松(Pinuskoraiensis)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)和長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)等樹(shù)種的種源試驗(yàn)研究[2，3]。同工酶標(biāo)記發(fā)明后，被先后運(yùn)用到歐洲赤松(Pinussylvestris)、云杉(Piceaasperata)、紅松、顫楊(Populustremuloide)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)和歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)等重要林木遺傳多樣性研究中[4-6]。隨后，DNA標(biāo)記的出現(xiàn)及其技術(shù)自身的優(yōu)點(diǎn)，被迅速運(yùn)用到林木遺傳多樣性研究中并極大地推動(dòng)了該領(lǐng)域的研究進(jìn)程，如歐洲赤松、栲樹(shù)(Castanopsisfargesii)、挪威云杉(Piceaabies)、山毛櫸、歐洲刺槐(Robiniapseudoacacia)、云杉、海岸松(Pinuspinaster)、雪松(Cedrusdeodara)、紅松、木荷(Schimasuperba)、長(zhǎng)葉榧(Torreyajackii)和白皮松(Pinusbungeana)等一些主要用材和珍稀瀕危樹(shù)種均采用DNA標(biāo)記進(jìn)行了研究，是林木遺傳多樣性研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)[7]。目前為止，雖然大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相繼有楊樹(shù)、桉樹(shù)和歐洲赤松等少數(shù)幾個(gè)樹(shù)種完成了全基因測(cè)序，這為基于SNP技術(shù)為基礎(chǔ)的林木遺傳多樣性及輔助選擇育種提供了可能，然而對(duì)于多數(shù)植物與樹(shù)木而言仍然缺乏全基因組序列，因此，目前基于基因組非編碼區(qū)變異變?yōu)榛A(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)仍是多數(shù)植物遺傳多樣性研究中的主要方法與技術(shù)。

群體遺傳學(xué)的研究基礎(chǔ)是DNA序列變異。同源DNA序列的遺傳分化程度是衡量群體遺傳結(jié)構(gòu)的主要指標(biāo)，其分化式樣則是理解群體遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生和維持的進(jìn)化內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力諸如遺傳突變、重組、基因轉(zhuǎn)換的前提[8]。因此，在遺傳多樣性研究中，要盡可能地揭示出該物種全基因組區(qū)域的DNA序列的變異，這樣才能全面反映出其遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，為后期資源的保存和利用奠定基礎(chǔ)。DNA分子標(biāo)記，不同的標(biāo)記及引物反映的基因組區(qū)域的不同DNA序列變異，因此如果標(biāo)記數(shù)量較少時(shí)，可能無(wú)法全部覆蓋基因組上產(chǎn)生變異的所有區(qū)域，因此不可能揭示該變異的全部信息[9]，而數(shù)量過(guò)多，不能增加信息量還會(huì)造成額外的實(shí)驗(yàn)成本。因此，對(duì)于遺傳多樣性研究中，究竟采用多少標(biāo)記足以揭示其群體的遺傳結(jié)構(gòu)是一個(gè)值得重視的問(wèn)題。如Julio等在研究薔薇的遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于雜合度的估算，必須有10個(gè)以上的個(gè)體和20個(gè)以上的標(biāo)記[10]。而Reyazu等在黃麻(Corchorusspecies)遺傳多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，15對(duì)與41對(duì)SSRs引物揭示的信息量相同[11]。白樺(Betulaplatyphylla)是一種分布范圍廣、適用性強(qiáng)、用途廣泛的闊葉速生樹(shù)種，然而，有關(guān)白樺遺傳多樣性研究報(bào)道中 ，同樣也沒(méi)有重視到標(biāo)記數(shù)量對(duì)遺傳參數(shù)結(jié)果與遺傳結(jié)果影響的問(wèn)題。

SRAP ( Sequence-related amplified polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性) 標(biāo)記建立以來(lái)，由于其操作簡(jiǎn)便快速、成本低、可信度高、易于測(cè)序等特點(diǎn)備受分子生物學(xué)家的青睞[9]，被迅速應(yīng)用到蓮藕(Nelumbonucif)[10]、桃(Amygdaluspersica)[11]花生(Arachishypogaea)[12]、油菜(Brassicanapus)[13]、黃瓜(Cucumissativus)[14]、甘薯(Dioscoreaesculenta)[15]和西瓜(Citrulluslanatus)[16]等植物的種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建(包括轉(zhuǎn)錄圖譜)、重要性狀標(biāo)記乃至基因分離克隆等方面得到了應(yīng)用。本文通過(guò)對(duì)不同SRAP引物對(duì)白樺遺傳多樣性研究結(jié)果的影響的研究，提出SRAP標(biāo)記研究白樺遺傳多樣性引物數(shù)量的標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上提出標(biāo)記引物確定的計(jì)算公式。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料來(lái)源

試驗(yàn)材料來(lái)自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)白樺種源試驗(yàn)林，共15個(gè)種源，分別為：新疆、涼水、汪清、露水河、小北湖、輝南、桓仁、草河口、綽爾、寧夏、莫爾道嘎、清源、東方紅、帽兒山、烏伊嶺。每個(gè)種源隨機(jī)選取20個(gè)個(gè)體，共計(jì)300個(gè)樣本。2012年6月采取當(dāng)年生嫩葉，用密封袋封好，做好標(biāo)記，放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1白樺葉片基因組DNA提取白樺葉片基因組DNA提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.2反應(yīng)體系及反應(yīng)程序SRAP該反應(yīng)體系為20 μL：0.21×106μgL-1DNA，1.5 μL；25 mmolL-1Mg2+，1.4 μL；5 UμL-1Taq酶，0.25 μL；2.5 mmolL-1dNTPs，2 μL；10 μmL-1引物，0.35 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min[13，14]。

1.2.3引物篩選本研究中所用SRAP引物根據(jù)文獻(xiàn)[15]中的引物序列，在上海生工合成。從15個(gè)種源中選取地理位置最近的2個(gè)種源(莫爾道嘎和桓仁)，每個(gè)種源選5個(gè)個(gè)體用于引物的篩選。以條帶清晰并且群體與個(gè)體間至少有一條差異條帶的引物為選擇標(biāo)準(zhǔn)，從合成的30對(duì)引物中，篩選出17對(duì)條帶清晰、多態(tài)性高的引物用于實(shí)驗(yàn)分析。引物序列如表1所示。

表1　SRAP引物序列

1.2.4SRAP引物數(shù)量按5、7、9、11、13、15、17對(duì)SRAP引物對(duì)15個(gè)白樺種源進(jìn)行擴(kuò)增和分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

電泳圖譜中的每一條帶均代表了引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，可記為一個(gè)分子標(biāo)記，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)物在膠上的對(duì)應(yīng)位置，估計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，有帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”[16]。所得結(jié)果為一二元數(shù)據(jù)矩陣，利用Popgene32軟件計(jì)算各項(xiàng)遺傳參數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1不同標(biāo)記引物數(shù)量的白樺群體遺傳多樣性

按5、7、9、11、13、15、17對(duì)SRAP引物對(duì)15個(gè)白樺種源、300個(gè)個(gè)體進(jìn)行SRAP擴(kuò)增并對(duì)各遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明，引物數(shù)量不同時(shí)，得到的白樺群體遺傳多樣性各項(xiàng)參數(shù)的大小也不同。如5對(duì)特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8)共檢測(cè)到46個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)有45，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)97.83%，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量為21～33、多態(tài)位點(diǎn)百分率在45.65%～71.74%，平均等位基因數(shù)在1.456 5～1.717 4，有效等位基因數(shù)在1.200 8～1.333 9，Nei’s指數(shù)在0.123 1～0.202 6，Shannon指數(shù)在0.192 6～0.314 1，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大均為涼水種源，最小為草河口種源。白樺種源總基因多樣性為0.234 3，種群內(nèi)基因多樣性為0.168 2，種群間的遺傳多樣性為0.066 1，種源間分化系數(shù)為0.283 0，說(shuō)明71.70%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，28.30%存在于種源間，基因流Nm為 1.272 8。

7對(duì)SRAP引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3)共檢測(cè)到62個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)有61，多態(tài)位點(diǎn)百分率為98.38%，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量在26～61之間、多態(tài)位點(diǎn)百分率在41.94%～98.38%，平均等位基因數(shù)在1.419 4～1.709 7，有效等位基因數(shù)在1.205 8～1.295 3、Nei’s指數(shù)在0.125 2～0.214 1、Shannon指數(shù)在0.193 1～0.320 6，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大與最小種源分別為涼水和淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.243 7，種群內(nèi)和種群間基因多樣性為0.166 1和0.077 6，種源間分化系數(shù)為0.318 3，說(shuō)明68.16%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，31.84%存在于種源間，基因流Nm為1.070 6。

9對(duì)SRAP引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9)檢測(cè)到白樺各種源平均等位基因數(shù)為1.369 9～1.726 0，有效等位基因數(shù)1.176 3～1.373 9，Nei’s指數(shù)在0.107 6～0.216 4，Shannon指數(shù)在0.166 8～0.325 3，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量為27～72、多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)36.99%～98.63%，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.248 8，種群內(nèi)基因多樣性Hs為0.163 8，種群間的遺傳多樣性為0.077 6，種源間分化系數(shù)為0.341 9，說(shuō)明65.84%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，34.16%存在于種源間，基因流Nm為0.962 5。

11對(duì)特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9、me4em11、me5em4)檢測(cè)到白樺各種源平均等位基因數(shù)為1.348 3～1.752 8，有效等位基因數(shù)為1.165 8～1.367 2，Nei’s指數(shù)為0.101 3～0.223 4，Shannon指數(shù)為0.157 1～0.344 2，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量為31～87，多態(tài)位點(diǎn)百分率為34.8%～75.68%，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.248 1，種群內(nèi)基因多樣性為0.162 9，種群間的遺傳多樣性為0.085 2，種源間分化系數(shù)為0.343 5，說(shuō)明65.66%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，34.34%存在于種源間，基因流Nm為0.955 7。

13對(duì)特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9、me4em11、me5em4、me5em11、me6em12) 檢測(cè)到白樺各種源平均等位基因數(shù)為1.403 8～1.769 2，有效等位基因數(shù)1.191 3～1.379 0，Nei’s指數(shù)在0.118 5～0.229 1，Shannon指數(shù)0.184 0～0.352 0，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量為42～80，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)40.38%～76.92%，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.255 6，種群內(nèi)基因多樣性為0.168 4，種群間的遺傳多樣性為0.087 2，種源間分化系數(shù)為0.341 1，說(shuō)明65.88%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，34.12%存在于種源間，但基因流Nm為0.966 0。

15對(duì)特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9、me4em11、me5em4、me5em11、me6em12)檢測(cè)到白樺各種源平均等位基因數(shù)為1.408 3～1.791 7，有效等位基因數(shù)為1.211 6～1.396 4，Nei’s指數(shù)為0.125 3～0.239 3，Shannon指數(shù)為0.190 9～0.367 0，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量為42～80，多態(tài)位點(diǎn)百分率為40.38%～76.92%，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.262 3，種群內(nèi)基因多樣性Hs為0.173 0，種群間的遺傳多樣性為0.089 3，種源間分化系數(shù)為0.340 6，說(shuō)明65.96%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，34.05%存在于種源間，但基因流Nm為0.967 9。

利用篩選出的17對(duì)特異性SRAP引物檢測(cè)到白樺各種源平均等位基因數(shù)為1.363 0～1.829 6,有效等位基因數(shù)為1.188 1～1.415 3，Nei’s指數(shù)為0.111 4～0.248 3，Shannon指數(shù)為0.169 7～0.379 9，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量為49～112，多態(tài)位點(diǎn)百分率為36.3%～82.96%，各種源上述遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，最大均為涼水種源，最小為清源種源。白樺種源總基因多樣性為0.2591，種群內(nèi)基因多樣性為0.170 7，種群間的遺傳多樣性為0.088 4，種源間分化系數(shù)為0.340 9，說(shuō)明65.88%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，34.12%存在于種源間，基因流Nm為0.966 5。

表2　不同引物數(shù)量遺傳參數(shù)比較

注：a為引物數(shù)量為5對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果，b為引物數(shù)量7對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果，c為引物數(shù)量9對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果，d為引物數(shù)量11對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果，e為引物數(shù)量13對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果，f為引物數(shù)量15對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果，g為引物數(shù)量17對(duì)時(shí)白樺種源的聚類(lèi)結(jié)果

2.2白樺種源不同樣本數(shù)量時(shí)群體間親緣關(guān)系

為了進(jìn)一步分析引物數(shù)量對(duì)于群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的影響，對(duì)不同標(biāo)記數(shù)量分析了白樺15個(gè)種源間的遺傳距離并進(jìn)行了聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，引物數(shù)量不同，不僅對(duì)不同種源間的遺傳距離的估算結(jié)果產(chǎn)生影響，而且得到的白樺種源間進(jìn)化關(guān)系存在一定的差異(圖1)。不同引物數(shù)量，反映出遺傳距離最近與最遠(yuǎn)的種源也存在差異，如當(dāng)引物數(shù)為7、13、15和17對(duì)時(shí)，遺傳距離最小的2個(gè)種源均為莫爾道嘎和桓仁；而引物數(shù)為5、9和11對(duì)時(shí)，遺傳距離最小的2個(gè)種源為清源和寧夏。引物數(shù)量為9、11、13、15和17對(duì)時(shí)，遺傳距離最大的2個(gè)種源均為涼水和草河口，而引物數(shù)量為7對(duì)時(shí)，涼水和東方紅種源的遺傳距離最大；引物數(shù)量為5對(duì)時(shí)，涼水和烏伊嶺種源的遺傳距離最大。從上述不同引物數(shù)量白樺種源聚類(lèi)結(jié)果來(lái)看，在相同的遺傳距離處(如0.11處)，不同引物數(shù)量導(dǎo)致白樺種源聚類(lèi)類(lèi)群數(shù)量各不相同，如當(dāng)引物數(shù)量為5對(duì)時(shí)，15個(gè)種源聚成3類(lèi)；當(dāng)引物數(shù)量為5對(duì)時(shí)，15個(gè)種源聚成3大類(lèi)群；引物數(shù)量為7和9對(duì)時(shí)，聚成4類(lèi)。同時(shí)，上述不同聚類(lèi)結(jié)果中，包含的種源也各不相同，總體來(lái)說(shuō)，隨著引物數(shù)的增多，聚類(lèi)數(shù)量與每個(gè)類(lèi)別中包括的種源趨于相同。如當(dāng)引物數(shù)量為5對(duì)時(shí)， 15個(gè)種源可聚成3個(gè)類(lèi)群：涼水種源聚為一類(lèi)，烏伊嶺聚為一類(lèi)，其余種源聚成一大類(lèi)(圖1 a)。當(dāng)引物數(shù)量為7對(duì)時(shí)，可聚成4個(gè)類(lèi)群：涼水種源聚為一類(lèi)，輝南聚為一類(lèi)，汪清、新疆、露水河聚成一類(lèi),其余種源聚成一大類(lèi)(圖1 b)。當(dāng)引物數(shù)量為9對(duì)時(shí)，可聚成4個(gè)類(lèi)群：涼水種源聚為一類(lèi)，輝南聚為一類(lèi)，汪清、新疆、露水河聚成一類(lèi)，其余種源聚成一大類(lèi)(圖1 c)。當(dāng)引物數(shù)量為11對(duì)時(shí)，可聚成5個(gè)類(lèi)群：涼水種源單獨(dú)聚為一類(lèi)；汪清、新疆、露水河種源聚為一類(lèi)；小北湖、桓仁、莫爾道嘎、輝南聚為一類(lèi)；草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類(lèi)，東方紅、烏伊嶺、帽兒山種源聚為一類(lèi)(圖1d)。當(dāng)引物數(shù)量為13對(duì)時(shí)，可聚成5個(gè)類(lèi)群：涼水、汪清種源聚為一類(lèi)，新疆、露水河種源聚為一類(lèi)，小北湖、輝南、莫爾道嘎和桓仁種源聚為一類(lèi)，草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類(lèi)(圖1 e)。當(dāng)引物數(shù)量為15對(duì)時(shí)，可聚成6個(gè)類(lèi)群：涼水、汪清種源聚為一類(lèi)；新疆、露水河種源聚為一類(lèi)，桓仁為一類(lèi)、東方紅、烏伊嶺、帽兒山聚為一類(lèi)，小北湖、輝南、莫爾道嘎種源聚為一類(lèi)，草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類(lèi)(圖1 f)。當(dāng)引物數(shù)量為17對(duì)時(shí)，可聚成5個(gè)類(lèi)群：涼水、汪清種源聚為一類(lèi)；新疆、露水河種源聚為一類(lèi)；小北湖、輝南、桓仁、莫爾道嘎種源聚為一類(lèi)；草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類(lèi)；東方紅、烏伊嶺、帽兒山聚為一類(lèi)(圖1 g)。

2.3引物數(shù)量和白樺遺傳參數(shù)的相關(guān)分析

為了進(jìn)一步弄清SRAP引物數(shù)量對(duì)白樺主要遺傳參數(shù)影響的大小，對(duì)引物數(shù)量和各遺傳參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析(表3)，結(jié)果表明，引物數(shù)量白樺群體的有效等位基因數(shù)量Ne、Nei’s基因多樣性指數(shù)H、Shannon’s信息多樣性指數(shù)I、多態(tài)位點(diǎn)、多態(tài)位點(diǎn)百分率和群體基因多樣性間呈極顯著相關(guān)，而群體間分化系數(shù)與基因流與引物數(shù)量之間顯著相關(guān)，而與其他遺傳參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)。

表3　SRAP引物數(shù)量與主要遺傳參數(shù)的相關(guān)性

注：表格內(nèi)上面數(shù)字為相關(guān)系數(shù)，下面為顯著性水平

2.4白樺遺傳多樣性引物數(shù)量的確定

在群體遺傳多樣性研究中，檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)越高越有利于分析和研究群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，因此對(duì)白樺種源不同樣本數(shù)量與多態(tài)位點(diǎn)百分率進(jìn)行擬合分析(圖2)，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，兩者之間極顯著線性回歸，其決定系數(shù)為93.9%，表明兩者之間存在較好的相關(guān)性。

我們?cè)诎讟暹z傳多樣性研究時(shí)，可在綜合考慮成本、技術(shù)難度等基礎(chǔ)上，根據(jù)所需多態(tài)位點(diǎn)百分率大小，計(jì)算出所需樣本的數(shù)量。如當(dāng)白樺遺傳多樣性研究時(shí)，以最低所需多態(tài)位點(diǎn)百分率98.5%為標(biāo)準(zhǔn)，則每個(gè)種源所需引物數(shù)量為14、16對(duì)時(shí)，實(shí)際操作中可設(shè)為15對(duì)標(biāo)記。

3結(jié)論

3.1SRAP引物數(shù)量對(duì)白樺種源遺傳參數(shù)影響不同。其中，引物數(shù)量與白樺群體的有效等位基因數(shù)量、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息多樣性指數(shù)I、多態(tài)位點(diǎn)、多態(tài)位點(diǎn)百分率和群體基因多樣性間呈極顯著相關(guān)，而群體間分化系數(shù)與基因流與引物數(shù)量之間顯著相關(guān)，而與其他遺傳參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)。不同標(biāo)記數(shù)量與存在顯著差異的遺傳參數(shù)之間均呈正相關(guān)，然而，除5個(gè)SARP標(biāo)記數(shù)時(shí)，15個(gè)白樺種源內(nèi)多態(tài)位百分率最低為草河口種源，而7個(gè)標(biāo)記以上時(shí)，分析發(fā)現(xiàn)多態(tài)位百分率最低均為淖爾種源。

除此之外，不同標(biāo)記數(shù)量反映出的白樺不同種源間各遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)基本相似，表明不同引物數(shù)量并不影響白樺各種源間遺傳參數(shù)的變化趨勢(shì)。

3.2SRAP不同引物數(shù)量對(duì)白樺15個(gè)種源間進(jìn)化關(guān)系的分析結(jié)果有較大影響。當(dāng)引物數(shù)量分別為5和7時(shí)，反映出的遺傳距離最小與最大的種源均不同，當(dāng)引物數(shù)量為9和11對(duì)時(shí)，反映出的遺傳距離最小種源不同，但遺傳距離最大的2個(gè)種源相同，均為涼水和草河口；引物數(shù)量超過(guò)13對(duì)時(shí)，種源間遺傳距離最小與最大的2對(duì)種源分別為莫爾道嘎和桓仁、涼水和草河口。而且，隨著SRAP引物數(shù)量增加，在遺傳距離為0.11處，分別可將15個(gè)種源聚類(lèi)成3、4、4、5、6、5和5個(gè)類(lèi)別，表明隨著引物數(shù)量的增加，區(qū)分不同種源間遺傳差異的能力總體上也隨之提高。

3.3SRAP引物數(shù)量與其多態(tài)位點(diǎn)百分率呈線性相關(guān)，且決定系數(shù)達(dá)93.9%。并以此為公式計(jì)算出開(kāi)展白樺遺傳多樣性研究時(shí)，如設(shè)定要探測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)98.5%以上時(shí)，白樺遺傳多樣性研究中SRAP引物數(shù)量設(shè)定為15個(gè)。

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Effects of Number of Labeling Primers on Genetic Diversity ofBetulaplatyphylla

Zhao Shuangjing, Liu Yingying, Wei Minjing, Yang Chuanping, Wei Zhigang

〔State Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding (Northeast Forestry University), Harbin 150040,China〕

AbstractTaking 300 samples from 15 provenance in experimental forest farm for Betula platyphylla in Maoershan Experimental Forest Farm as experimental materials,the effects of different number of SRAP on primers genetic diversity of Betula platyphylla were analyzed. The formula for labeling primers was proposed. Result shows that the number of SRAP primer does not affect the trends for genetic parameters among provenances of Betula platyphylla. The ability of distinguishing genetic differences among different provenances increase with the increase of the number for labeling primers. While SRAP primer number being 15 pairs,polymorphic percentage which can be detected reach above 98.5%.

Key wordsBetula platyphylla;number of labeling primers;genetic diversity

中圖分類(lèi)號(hào)：S792.153

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.13601/j.issn.1005-5215.2016.04.002

作者簡(jiǎn)介：趙雙菁，碩士，Email:zshuangjing2006@163.com通訊作者：魏志剛，教授，博士，Email:zhigangwei1973@163.com

基金項(xiàng)目：863課題白樺、桉樹(shù)等分子育種與品質(zhì)創(chuàng)制(2011AA100202)

收稿日期：2016-03-21

文章編號(hào)：1005-5215(2016)04-0006-05