小麥N離子束注入誘變育種的應(yīng)用研究

李強(qiáng) 任立凱 陳鳳 孫中偉 王康君 郭明明

摘要：為了探尋新的育種手段，解決目前小麥常規(guī)育種中普遍存在的種質(zhì)資源匱乏問(wèn)題以提升育種效率，開(kāi)展了小麥N離子束注入誘變育種與常規(guī)育種相結(jié)合的應(yīng)用研究。以N離子不同劑量注入小麥品種連麥6號(hào)籽粒進(jìn)行誘變處理，經(jīng)過(guò)M1代損傷效應(yīng)分析，M2代突變體的分類(lèi)統(tǒng)計(jì)和篩選，M3代常規(guī)系譜法穩(wěn)定性鑒定，考察了N離子注入對(duì)連麥6號(hào)農(nóng)藝性狀的誘變效應(yīng)。結(jié)果表明：N離子注入對(duì)連麥6號(hào)的誘變效應(yīng)在M1代顯著地表現(xiàn)在株高、結(jié)實(shí)率、抽穗期和成株率上，M2代的突變率隨N離子注入劑量的增加而提高，由低到高3種劑量處理的突變率分別為5.38%、8.98%和11.02%，篩選出的3個(gè)超親變異性狀（矮稈多蘗、早熟性、大穗）在M3代因不同的劑量處理其重復(fù)穩(wěn)定性存在明顯差異；試驗(yàn)明確了不同劑量的離子注入處理對(duì)小麥生理性狀影響的變異效應(yīng)不同。

關(guān)鍵詞：小麥；N離子束；誘變育種

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.103.52文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）07-0018-05

黃淮麥區(qū)是我國(guó)小麥的主產(chǎn)區(qū)，多年的常規(guī)雜交育種致使小麥育種的遺傳背景變得單一，品種的同質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重。實(shí)踐中，借助遠(yuǎn)緣雜交來(lái)打破此瓶頸，又遇屬間不育性障礙且很難突破。誘變育種技術(shù)在種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良上具有獨(dú)特作用，它可以誘發(fā)基因突變，打破基因連鎖，在相對(duì)較短的世代周期內(nèi)獲得常規(guī)育種方法難以獲得的新類(lèi)型、新性狀、新基因，可以豐富育種材料的遺傳背景。在眾多誘變手段中離子束的誘變作為后起之秀倍受關(guān)注。這不僅是因?yàn)殡x子束生物工程的應(yīng)用發(fā)端于我國(guó)[1，2]，更是因?yàn)樗幌笃渌椛湔T變只限于能量作用引起 DNA鏈斷裂，更有其能量、質(zhì)量、電荷的三因子協(xié)同作用產(chǎn)生的生物分子原子移位、重組和化合的優(yōu)勢(shì)[3]，具有損傷輕、存活率高、突變率高和突變譜廣、重復(fù)性好等特點(diǎn)[4～6]。

目前離子束誘變育種研究正在國(guó)內(nèi)外蓬勃展開(kāi)，涉及方面從突變體庫(kù)的選擇構(gòu)建、品性改良、種質(zhì)創(chuàng)新和離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因[7～12]到以?xún)?yōu)化離子束誘變效應(yīng)的誘變離子、劑量、時(shí)間及不同誘變靶標(biāo)材料的對(duì)應(yīng)選擇方面[13～17]。從前人的這些研究成果看，離子束誘變邊際效應(yīng)最大化的受制因素往往與靶標(biāo)材料密切相關(guān)。因此要獲得好的誘變效率，誘變?cè)吹膮?shù)最佳組合必須以誘變材料為轉(zhuǎn)移，不能教條地套用。為了提高處理后代的突變頻率和突變類(lèi)型，通常誘變育種選用對(duì)本地區(qū)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性好、綜合性狀優(yōu)良、遺傳背景豐富且某些性狀尚存在改良余地的品種為主。本院自育品種連麥6號(hào)從親本遺傳背景和生產(chǎn)生態(tài)適應(yīng)性看大致符合這些條件，為此我們選擇該品種開(kāi)展了小麥N離子束注入誘變育種應(yīng)用研究，試圖找到一套適合本地品種和生態(tài)條件的與常規(guī)育種相得益彰互為補(bǔ)充的育種方法。

1材料與方法

1.1供試材料

供試小麥品種連麥6號(hào)為本院自產(chǎn)。

1.2輻照處理

離子注入委托中囯科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所完成。注入離子為N離子，能量為30 keV，束流大小為10 mA，真空度為10-2～10-3 Pa，注入劑量分別為2×1017 、4×1017、6×1017 N+/cm2。每個(gè)離子注入劑量處理均為1 000粒干種子。

1.3田間試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉帶河試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。2012年11月5日播種M1代，行距 22.5 cm，株距2 cm，每小區(qū)播種500粒，重復(fù)2次。苗期每小區(qū)定點(diǎn)調(diào)查田間發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和成活率，考察不同劑量處理對(duì)連麥6號(hào)種子的損傷情況，同時(shí)單株掛牌跟蹤調(diào)查生育期。收獲前每小區(qū)隨機(jī)取樣20株室內(nèi)考種。M1代成熟時(shí)不做選擇，按處理單收主莖穗。

2013年10月15日對(duì)上年收獲的單株主莖穗按不同誘變處理單株單行種植M2代，每單株行長(zhǎng)1 m， 每隔10行種1行野生型連麥6號(hào)為對(duì)照，以便于對(duì)比觀察。調(diào)查各處理M2代群體的生育期、株高、分蘗、穗長(zhǎng)等農(nóng)藝性狀，觀察記載其它性狀（株、粒、葉的形狀、顏色等）變異，以超野生型連麥6號(hào)（CK）不同數(shù)量性狀平均值3倍標(biāo)準(zhǔn)差之外的個(gè)體作為突變株，統(tǒng)計(jì)各處理不同類(lèi)型的突變率，同時(shí)按處理根據(jù)小麥不同生育進(jìn)程有所側(cè)重地分莖稈、熟性、穗部三大類(lèi)變異性狀進(jìn)行株選淘汰，保留性狀向優(yōu)突變的變異株。

2014年10月20日再對(duì)中選的變異株M2代按不同的離子注入劑量處理依常規(guī)育種系譜法建立株系譜，針對(duì)所篩選的變異性狀田間觀察和室內(nèi)考種對(duì)M3代每個(gè)株系進(jìn)行穩(wěn)定性重復(fù)鑒定，選擇性狀向優(yōu)突變且遺傳特性相對(duì)穩(wěn)定的材料。

2結(jié)果與分析

2.1N離子束不同注入劑量對(duì)連麥6號(hào)M1代的影響

考慮傳統(tǒng)的物理誘變的遺傳通常表現(xiàn)為一代平、二代突、三代穩(wěn)的特點(diǎn)，所以在種植M1代時(shí)特意采用了晚播密植的方法，以盡可能降低分蘗數(shù)，利于集中突顯M1代主莖的誘變表達(dá)。從表1中可以看出，N離子的注入對(duì)連麥6號(hào)的損傷很明顯，M1代不僅出現(xiàn)了發(fā)芽勢(shì)弱的情況，而且發(fā)芽率和存活率亦出現(xiàn)雙低現(xiàn)象，三項(xiàng)指標(biāo)與CK的差異幾乎均達(dá)顯著或極顯著水平。從存活率指標(biāo)看，3個(gè)N離子注入劑量處理的存活率2個(gè)超過(guò)57%，1個(gè)接近50%，說(shuō)明選擇2×1017～6×1017 N+/cm2這個(gè)注入誘變劑量范圍對(duì)連麥6號(hào)是適宜的。從田間對(duì)比觀察看到，M1代也出現(xiàn)了一些諸如葉寬色黃、抽穗不一、穗子畸形、高矮不齊等現(xiàn)象，這顯然也是離子注入致?lián)p的表現(xiàn)。

為了更科學(xué)地作出評(píng)估判斷，進(jìn)一步對(duì)大量的室內(nèi)考種數(shù)據(jù)和田間觀察數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯觯步?jīng)N離子注入處理的株高、結(jié)實(shí)率、抽穗期、成株率與CK差異達(dá)極顯著或顯著水平，而其它三項(xiàng)穗部性狀表現(xiàn)差異不顯著。再?gòu)牟煌瑒┝刻幚黹g的比較看，除了成株率的差異達(dá)顯著外，其余的性狀指標(biāo)均不顯著。 由此表明與其它的誘變?cè)聪啾容^，N離子束的誘變效果在M1代就得到突現(xiàn)，而且這種表現(xiàn)是隨注入劑量增加而增大。但考慮M1代植株在遺傳上一般為復(fù)雜的突變嵌合體，其損傷效應(yīng)出現(xiàn)的變異一般不能傳遞給后代，所以只收主莖穗而不作選擇。

2.2N離子束不同注入劑量處理連麥6號(hào)M2代的變異表現(xiàn)

3個(gè)離子注入劑量處理由低到高分別收獲了593、486、395個(gè)主莖穗。M2代是誘變育種選擇的關(guān)鍵世代，為便于觀察甄別M2代的變異分離，對(duì)M1代主莖穗沒(méi)有混收混種，而是嚴(yán)格按不同N離子注入劑量處理建立起同源穗行種植圃。田間觀察，連麥6號(hào)M2代的變異分化非常豐富，不同劑量處理的1 474個(gè)穗行的15 857個(gè)單株中共有1 244 株出現(xiàn)一到多個(gè)性狀的突變，總表型突變率達(dá)7.85%。由表3可以看出，連麥6號(hào)M2代的突變率隨N離子注入劑量的增加而提高，由低到高 3種劑量處理的突變率分別為5.38%、8.98%和11.02%，多重比較差異顯著。這種趨勢(shì)顯然也與M1代的損傷效應(yīng)相吻合。細(xì)分變異類(lèi)型的差異還發(fā)現(xiàn)，突變?nèi)后w中以莖稈的突變頻率最高，其次為葉片、育性和熟性的變異，而穗部性狀的突變頻率相對(duì)較低。進(jìn)一步縱向比較處理間的突變差異，高劑量的穗部、莖稈和熟性突變率顯著高于中低劑量的突變，中劑量的葉片突變又顯著高于高劑量的突變。這表明對(duì)不同性狀的選擇存在著一個(gè)與之對(duì)應(yīng)的最佳注入誘變劑量。綜觀1 244個(gè)M2代變異株，負(fù)向弱親變異的有1 126株，占比高達(dá)90.5%，正向超親變異的占比很低，而且還多是正負(fù)變異性狀混搭株，僅占9.5%。

2.3N離子束不同注入劑量處理的連麥6號(hào)M3代的穩(wěn)定性表現(xiàn)

按矮稈多蘗、早熟性、大穗三種突變類(lèi)型從M2后代中選出相符的變異突變株57株，其中涉及莖稈性狀的24株、穗部性狀的18株、熟性的15株。按M2的種植方法建立株系圃，分別考量鑒定熟性、莖稈和穗部性狀變異的遺傳穩(wěn)定性。由表4可見(jiàn)，選出的3個(gè)超親變異性狀在不同劑量處理M3代上表現(xiàn)的重復(fù)穩(wěn)定性存在明顯差異。不同處理早熟性變異株抽穗期比CK提前1～3天，中低劑量處理的差異顯著；矮稈變異性狀穩(wěn)定性突出，3個(gè)劑量處理的平均株高分別比CK矮14.0、8.5 cm和11.7 cm，差異達(dá)顯著或極顯著水平；分蘗變異性狀，低劑量處理的統(tǒng)計(jì)差異顯著，單株平均分蘗比CK增2.6個(gè)，另兩個(gè)處理雖也表現(xiàn)增加，但不顯著；穗部變異性狀的穩(wěn)定性主要測(cè)定了主莖穗的粒數(shù)、穗長(zhǎng)和粒重3個(gè)指標(biāo)，從不同劑量處理的大穗突變株與之對(duì)應(yīng)的測(cè)定數(shù)據(jù)看，中高劑量處理的大穗突變株的大穗特性得到保持，3個(gè)測(cè)定指標(biāo)都顯著高于CK。綜上可見(jiàn)，從M2代篩選的3個(gè)超親突變性狀都基本得到保持，但各性狀尚存在較大的變幅，說(shuō)明這些性狀在M3代的穩(wěn)定性還不夠，還須進(jìn)一步作世代穩(wěn)定性篩選。

3討論與結(jié)論

試驗(yàn)完整觀察統(tǒng)計(jì)分析了N離子束不同劑量處理的連麥6號(hào)3個(gè)世代的農(nóng)藝性狀表型變異情況，可以看出，3種劑量的N離子束注入對(duì)連麥6號(hào)田間出苗的損傷隨注入劑量的增加而加劇，但并未呈現(xiàn)“馬鞍形”的存活率劑量效應(yīng)曲線(xiàn)[18]。這恰恰反映出不同小麥品種由于基因型的差異對(duì)注入離子劑量的耐受力和敏感性的差異。統(tǒng)計(jì)分析表明低能N離子束注入對(duì)連麥6號(hào)多項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生的影響在M1代就有顯著的表現(xiàn)。這與以往認(rèn)為誘變處理產(chǎn)生的M1代突變大多為隱性突變的現(xiàn)象有較大的出入，這種差異可能與注入的有生物活性的N離子與生物分子作用很強(qiáng)有關(guān)。但為避免M1代可能出現(xiàn)的突變嵌合體的干撓導(dǎo)致變異的丟失，所以收獲時(shí)未對(duì)其進(jìn)行選擇。

試驗(yàn)再次證明，M2代是誘變分離最大、出現(xiàn)變異類(lèi)型最多的一個(gè)世代，3個(gè)劑量處理的總突變率為7.85%。就連麥6號(hào)而言，突變率是隨N離子注入劑量的增加而提高，試驗(yàn)設(shè)定條件下2×1017～6×1017 N+/cm2的劑量范圍內(nèi)M1代的損傷程度愈重M2代的突變率愈高?？傮w上看突變?nèi)后w中以莖稈的突變頻率最高，其次為葉片、育性和熟性的變異，而穗部性狀的突變頻率相對(duì)較低。6×1017 N+/cm2注入劑量的誘變效率最好，其總突變率達(dá)11.02%，細(xì)分的莖稈、熟性以及穗部性狀的突變率都顯著高于其它劑量處理。值得注意的是：獲得的1 244個(gè)M2代變異株中負(fù)向弱親變異占絕對(duì)多數(shù)，正向超親變異的早熟、矮稈、優(yōu)良株型等表形突變以及穗粒數(shù)、粒重等微突變的占比相對(duì)較低，可供育種選擇的正向超親變異或混合型變異株僅有9.5%。但本試驗(yàn)中不同劑量間表現(xiàn)出的誘變差異還是給我們留下了對(duì)離子束誘變小麥性狀變異可調(diào)控的努力空間。

比較同源株系圃間的性狀穩(wěn)定性差異，一些超親的變異性狀在M3代上得到保持。2×1017 N+/cm2處理的矮稈多蘗突變性狀保持更好，而4×1017 N+/cm2和6×1017 N+/cm2注入劑量的大穗突變株的大穗特性得到保持。這表明，盡管離子束的誘變總體上表現(xiàn)為隨機(jī)性，但依作物品種和性狀選擇而定的不同誘變劑量還是相對(duì)能找到一個(gè)與之相對(duì)應(yīng)的最適選擇。從試驗(yàn)中還可看出，所選的變異性狀在M3代雖得以保持，但還存在較大變幅，而且大部分還是優(yōu)良互摻的混合型變異，這就需要緊扣育種目標(biāo)進(jìn)一步與常規(guī)育種相結(jié)合對(duì)其世代進(jìn)行穩(wěn)定或雜交改造。通過(guò)N離子束誘變可在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲得連麥6號(hào)的一些超親突變體，這不僅大大豐富了育種材料，也能提高育種效率。本試驗(yàn)表明不同劑量的離子注入處理對(duì)小麥生理性狀影響的變異效應(yīng)不同，如何進(jìn)一步提高小麥N離子束誘變效率，誘發(fā)篩選出符合育種目標(biāo)的突變類(lèi)型，豐富種質(zhì)資源，則是今后需要深化研究的方面。

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