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      不同種類魚中snrpc的組織表達(dá)特征研究

      2016-05-17 20:03王紅瑩方瑞
      安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2016年8期
      關(guān)鍵詞:斑馬魚

      王紅瑩+方瑞

      摘 要:為了深入研究魚類RNA剪接相關(guān)基因snrpc的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR研究了斑馬魚成魚組織中snrpc mRNA的表達(dá)模式,并比較分析了鯽魚中snrpc的表達(dá)。結(jié)果顯示,斑馬魚snrpc在垂體和卵巢中有表達(dá),而鯽魚中在腎臟、垂體和卵巢中有表達(dá),表明snrpc在不同魚類中具有組織表達(dá)的差異性。

      關(guān)鍵詞:斑馬魚;snrpc;組織表達(dá)分析

      中圖分類號(hào) S965.299 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2016)08-21-02

      Abstract:In order to further study the mechanism of fish's snrpc relevant to RNA splicing,we researched the expression of mRNA in zebrafish's and crucian carp's tissues by RT-PCR. Zebrafish's snrpc expression in the pituitary and oocyte,while the crucian carp's expression in kidney pituitary and oocyte. Preliminary results show that zebrafish's snrpc has specific expression in different tissue.

      Key words:Zebrafish;Snrpc;Tissue distribution

      在負(fù)責(zé)RNA剪切的因子中,snRNP蛋白是最關(guān)鍵的一類。SNRPC是snRNP蛋白中的一種,但至今研究仍較少。在魚類早期發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞的快速分裂需要RNA的正確剪切,推測(cè)SNRPC在此過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。本研究中應(yīng)用RT-PCR研究斑馬魚以及經(jīng)濟(jì)魚類鯽魚成魚組織中snrpc mRNA的表達(dá)模式,以期進(jìn)一步揭示SNRPC的作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)實(shí)驗(yàn)品種:斑馬魚、鯽魚。(2)主要儀器及設(shè)備:Sequi-Gen電泳儀系統(tǒng),Bio-RabGONGSI;定量移液器,Gilson;凝膠成像系統(tǒng),Bio-RabGONGSI;PCR儀,Bio-RabGONGSI;恒溫?fù)u床、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、低溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋,上海精宏。(3)主要試劑:PCR taq酶,TaKaRa;限制性內(nèi)切酶,NEB;質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、酶切膠回收試劑盒,上海生工;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,TOYOBO。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 snrpc基因引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上預(yù)測(cè)的snrpc的全長(zhǎng)序列,利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物。

      1.2.2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

      1.2.2.1 斑馬魚及鯽魚中各組織總RNA的提取及cDNA合成 斑馬魚和鯽魚各10條,分別取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、脂肪、肌肉、垂體、下丘腦、端腦、小腦、延髓、精巢、卵巢50~100mg,各加600μL TRIZOL;研磨并靜置3min,加氯仿抽提,離心后將上清液轉(zhuǎn)到新Rnase-free EP管中,在管中加入等體積的異丙醇沉淀;用75%乙醇洗滌,最后溶于Rnase free的ddH2O中。提取的RNA加入oligo dT引物,70℃孵育后加入RNA酶抑制劑1μL,dNTP 5μL,逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,42℃逆轉(zhuǎn)錄,得到各組織cDNA。

      1.2.2.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 RT-PCR中使用到的引物如下:

      PCR擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 snrpc在斑馬魚成魚各組織中mRNA的表達(dá) 通過(guò)提取各組織的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以α-tubulin作為內(nèi)參,進(jìn)行PCR反應(yīng),確保逆轉(zhuǎn)錄效率一致,再利用snrpc引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)電泳鑒定斑馬魚成魚各組織中mRNA水平,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,瓊(下轉(zhuǎn)130頁(yè))(上接21頁(yè))脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果,斑馬魚snrpc在垂體和卵巢中均有表達(dá),且條帶大小正確清晰,表達(dá)量相當(dāng)。

      2.2 snrpc在鯽魚成魚各組織中mRNA的表達(dá) 由于斑馬魚各組織的特異性,筆者設(shè)計(jì)出一組對(duì)照實(shí)驗(yàn),即在鯽魚成魚各組織中檢測(cè)snrpc mRNA的表達(dá),其結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出,鯽魚中snrpc mRNA在腎臟、垂體和卵巢中有表達(dá)。此結(jié)果與斑馬魚中不同。不同魚的snrpc在不同組織中表達(dá),具有不同的生物學(xué)功能。

      3 結(jié)論與討論

      根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果,斑馬魚中在P(垂體)和T(精巢)中有明顯的條帶,且條帶大小正確清晰,說(shuō)明斑馬魚snrpc mRNA在垂體和精巢中具有組織特異性。而在鯽魚中,在K(腎臟)和P(垂體)、T(即精巢)中有明顯的條帶,說(shuō)明鯽魚snrpc mRNA在腎臟、腦和精巢中具有組織特異性。魚類snrpc基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)基因,不同物種中具有不同的表達(dá)模式。據(jù)研究,snrpc基因在不同組織中表達(dá)的差異性與其RNA剪接活性有一定關(guān)系。此外,一些因子也和SNRPC共同作用并且參與了RNA的剪切。比如,轉(zhuǎn)錄因子EWS和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后,再和SNRPC作用來(lái)進(jìn)行RNA剪切的調(diào)節(jié)。TIA-1因子和U1 C蛋白共同作用后,可促進(jìn)snRNP的剪接效率。SNRPC的N末端可以和谷氨酸富含區(qū)域的C末端產(chǎn)生互作。當(dāng)然,要想了解snrpc基因在體內(nèi)的功能還需通過(guò)基因敲除等技術(shù),進(jìn)一步研究其蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,以揭示其在機(jī)體內(nèi)的作用。

      參考文獻(xiàn)

      [1]Knoop L.L.,Baker S.J.The splicing factor U1C represses EWS/FLI-mediated transactivation[J].Biol.Chem.,2000,275:24865-24871.

      [2]Ohkura N.,Yaguchi H.,Tsukada T.,et al.The EWS/NOR1 fusion gene product gains a novel activity affecting premRNA splicing[J].Biol.Chem.,2002,277:535-543.

      [3]Tian Q.,Streuli M.,Saito H.,Schlossman S.F.,et al.A polyadenylate binding protein localized to the granules of cytolytic lymphocytes induces DNA fragmentation in target cells[J].Cell,1991,67:629-639.

      [4]Fock W.L.,Chen C.L.,Lam T.J.,et al.Roles of an endogenous serum lectin in the immune protection of blue gourami,Trichogaster trichopterus(Pallus)against Aeromonas hydrophila[J].Fish.Shel.Immuno.,2001,11:101-113.

      [5]Wang H.Y.,Zhou L.,Gui J.F.Identification and characterization of an oocyte-specific small nuclear ribonucleoprotein polypeptide C in gibel carp,Comp[J].Biochem .Phys .B,2007,146:47-52.

      [6]王紅瑩,杜嫚.鯽魚一種新型SNRPC基因的蛋白表達(dá)和抗體制備分析[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,14(12):43-45.

      (責(zé)編:張宏民)

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