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      高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

      2016-05-17 20:04周成徐磊肖新謝越汪建飛馬忠友
      安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2016年8期

      周成+徐磊+肖新+謝越+汪建飛+馬忠友

      摘 要:該研究從農(nóng)田土壤中分離得到67株細(xì)菌,并從中選出一株高產(chǎn)纖維素酶菌株。將這些菌株接種到纖維素培養(yǎng)基上,在pH 5.5和28℃的條件下,利用剛果紅染色溶液進(jìn)行染色后,測(cè)其水解透明圈與菌落的比值的大小,進(jìn)行初步篩選。將這些初篩的菌株接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)后,制得粗酶液,并分析羧甲基纖維素酶(CMC)活力測(cè)定和濾紙酶(FP)活力及β-葡萄糖苷酶(BG)。在不同溫度的條件下,對(duì)纖維素酶活力測(cè)定,最終篩選出曲霉A25(Aspergillus sp.)這一株菌株,最適酶活溫度為50℃。產(chǎn)纖維素酶酶活力分別為:CMC酶活達(dá)2 340.92 U/mL;FP酶活達(dá)2.66U/mL;BG酶活達(dá)164.72U/mL。

      關(guān)鍵詞:羧甲基纖維素酶;濾紙酶;β-葡萄糖苷酶;曲霉A25

      中圖分類號(hào) S154 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2016)08-22-04

      Abstract:67 strains of soil bacteria were isolated form farmland,from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium,and a preliminary screening was conducted,in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore,these selected strains were cultured,and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose(CMC),filter paper enzyme(FP)and β-glucosidase(BG).Under different temperature conditions,the activity of cellulase was determined,and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following:CMC amounted to 2 340.92 U/mL,F(xiàn)P activity amounted to 2.66 U/mL,and BG activity amounted to 164.72 U/mL.

      Key words:Cerboxymethl cellulose;Filter paper enzyme;β- glucosidase;Aspergillus A25

      纖維素物質(zhì)是地球上含量最豐富的碳水化合物[1],而目前人類對(duì)纖維素的開發(fā)與利用還非常有限,因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。目前,對(duì)纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學(xué)手段,以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段[2]。生物法由于對(duì)設(shè)備要求低,分解后的產(chǎn)物易回收利用,以及對(duì)環(huán)境污染較小等特點(diǎn)而備受重視。纖維素是一個(gè)復(fù)雜酶系,根據(jù)其功能的不同可分為3類:作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡聚糖酶(CMC);作用于無(wú)定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶(FP);以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶(BG)[3-5]。協(xié)同作用才能將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景[5]。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩,A25這一株菌株是本次實(shí)驗(yàn)所篩選的,具有較高降解纖維素活力的菌株,本文對(duì)其纖維素酶的生產(chǎn)培養(yǎng)特性進(jìn)行研究,對(duì)于了解其降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用都有重要意義。

      1 材料與方法

      1.1 材料 從農(nóng)田土壤中分離得到67株土壤細(xì)菌。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱0.05g經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中,用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL,再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻,置于沸水中煮沸5min,取出置與冷水中冷卻到室溫,測(cè)其OD530值。根據(jù)OD值,以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo),吸光值為橫坐標(biāo),列出直線回歸方程(Y=aX+b)。

      1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下,將67株菌株接種到纖維素培養(yǎng)基中,放在培養(yǎng)箱里溫度為28℃,培養(yǎng)48h。

      1.2.3 剛果紅染色 把培養(yǎng)好的霉菌用剛果紅染色劑覆蓋培養(yǎng)皿一層進(jìn)行染色30min。然后用0.9%生理鹽水沖洗2~3次,觀察其透明圈的大小,并計(jì)算出H/C的比值即酶活,(酶活性=透明圈直徑的值與菌落直徑的比值)。根據(jù)比值的大小進(jìn)行初步篩選。

      1.2.4 粗纖維酶液的制備 在無(wú)菌操作下,將初步篩選的7株霉菌分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng)3~4d,溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為160r。

      1.2.5 纖維素酶發(fā)酵液的處理 纖維素酶霉菌搖瓶培養(yǎng)好后,用循環(huán)水式抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾。將濾液轉(zhuǎn)入到原三角燒瓶中,放入冰箱備用。

      1.2.6 酶活力的測(cè)定 采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)[6-7]。

      1.2.7 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)酶活力測(cè)定 以2.0mL 20%(w/v)羧甲基纖維素鈉溶液為底物,用pH5.0檸檬酸緩沖液配制)。加1mL稀釋酶液于50℃,恒溫水浴反應(yīng)30min,然后加入2mL DNS顯色液,終止反應(yīng),煮沸5min,再放入冰水中冷卻至室溫。用722S分光光度計(jì)在530nm處測(cè)定光密度OD值,同時(shí)相同條件作空白樣調(diào)零。

      1.2.8 濾紙(FP)酶活力測(cè)定 精確吸取4.0mL稀釋酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液,置于試管中,加入新華5號(hào)濾紙條(1×3cm)一條,滴入甲苯2~3滴防腐。40℃反應(yīng)24h。吸取上述濾紙酶液2.0mL加入蒸餾水1.0mL,2.0mL DNS顯色液,終止反應(yīng)。沸水煮沸5min,然后再放入冷水中冷卻至室溫。在530nm處測(cè)定光密度OD值,同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

      1.2.9 β-葡萄糖酶(BG)活法測(cè)定 取1.0mL稀釋酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的1%的水楊酸溶液,50℃酶解30min,加入2.0mL DNS顯色液,終止反應(yīng),于沸水中水浴5min,用冷水冷卻至室溫,在530nm處測(cè)定其OD值,同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

      1.4 濾紙崩潰實(shí)驗(yàn) 取稀釋酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液置于試管中。(15×50cm)加入新華5號(hào)濾紙條(1×3cm)一條,滴入甲苯2~3滴(防腐),于恒溫箱內(nèi)40℃保溫24h。觀察濾紙崩潰情況,觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如下:+++表示濾紙完全沉在底部,搖動(dòng)試管后濾紙呈糊狀;++表示濾紙完全下沉,搖后呈小片狀;+表示濾紙沿底部呈毛狀,搖后部分溶化;-表示濾紙直立完整無(wú)缺,搖后不溶化。

      1.5 還原糖含量的測(cè)定 采用DNS法[9]測(cè)還原糖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 將67株菌株接種到羧甲基固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48h,用剛果紅染色靜止30min后測(cè)其H/C的比值,結(jié)果見(jiàn)表2。

      從本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株中,將各菌株分別采用纖維素固體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)并進(jìn)行篩選,從中篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌株。從表2這些菌株的透明圈的直徑與菌落的直徑比值大小可以看出,A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值較高,這7株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng),紅色水解透明圈較明顯、較大,具有較高的纖維素酶活力。H/C是透明圈與菌落的比值,比值越大酶活越強(qiáng)。根據(jù)紅色水解透明圈出現(xiàn)的快慢、大小可大致得出該菌株的產(chǎn)纖維素酶情況,這可作為初次判斷的依據(jù)。通過(guò)表2的結(jié)果說(shuō)明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有較高的酶活力。

      2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照1.2.1所描述的方法制備出標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線(圖1),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505,R2=0.996 8(y:葡萄糖濃度,x:OD530的值),通過(guò)直線回歸方程可以計(jì)算纖維素酶酶促反應(yīng)中產(chǎn)生葡萄糖的濃度,從而根據(jù)酶活力單位定義算出酶活。

      2.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 挑選上述試驗(yàn)中濾紙酶活性較高的7個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn),將所獲得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)后,在獲得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上制得粗酶液。測(cè)定其濾紙酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均設(shè)3個(gè)處理,取其平均值,如表3。

      2.4 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響 溫度對(duì)酶促反影響的原因主要有以下2個(gè)方面,一是溫度對(duì)酶蛋白穩(wěn)定性的影響,即對(duì)酶熱變性失活作用,二是溫度對(duì)酶促反應(yīng)本身的影響,其中可能包括影響酶和底物的結(jié)合,影響Vmax,影響酶和底物分子解離基團(tuán)的pK,影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴鍋中處理30min后,對(duì)菌體的酶活進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),反應(yīng)溫度對(duì)菌株A25的酶活有顯著影響,其最適酶活溫度為50℃,當(dāng)水浴處理溫度高于50℃或低于50℃時(shí),該菌株A25酶活減弱,但是培養(yǎng)液仍具有較高的纖維素酶活力;同時(shí)也表明該菌株所產(chǎn)的纖維素酶具有較高熱穩(wěn)定性??梢?jiàn),50℃所測(cè)得的酶活力最高,即此酶的最適酶活溫度為50℃。

      3 討論

      3.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖,水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀,使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈,根據(jù)水解圈的大小可粗略的估計(jì)菌株產(chǎn)酶的情況,然后選取透明圈較大的菌株進(jìn)行接種。剛果紅是對(duì)纖維素酶進(jìn)行初步篩選的試驗(yàn)方法,實(shí)驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)單。通過(guò)它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產(chǎn)物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min,纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶越多,產(chǎn)生的紅色水解透明圈越大,產(chǎn)纖維素酶速度越快,淺紅色水解透明圈出現(xiàn)的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低,但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力,不能定量說(shuō)明該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑(下轉(zhuǎn)127頁(yè))(上接24頁(yè))成線性關(guān)系,可以對(duì)酶活進(jìn)行初步定量[10]。

      3.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 已知纖維素酶的作用方式:CO酶是使天然纖維素晶體分鏈,起一個(gè)分離和水合作用,從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素;而C0酶雖不能水解天然纖維素,但能水解直鏈纖維素的β-l,4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖,纖維二糖再經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認(rèn)為,纖維素的降解關(guān)鍵是濾紙酶活的高低,再結(jié)合β-葡萄糖苷酶活,而CMC酶活只作參考。通過(guò)對(duì)7個(gè)菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行測(cè)定,初步篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗(yàn)表明,在50℃反應(yīng)時(shí)間30min,pH5.5時(shí)A25菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對(duì)A25進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn),以探明其最適的產(chǎn)酶條件,或?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步的誘變,以提高其酶活性應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

      3.3 溫度對(duì)纖維素酶活性的影響 從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中,在不同的水浴溫度下水浴處理30min后,對(duì)菌體的產(chǎn)酶量進(jìn)行檢測(cè)。為了確定酶活的最適溫度,通過(guò)測(cè)40~80℃不同溫度下的實(shí)驗(yàn)確定酶活,不同培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶有不同的影響,結(jié)果表明,曲霉A25水浴處理在40℃時(shí)酶活力表現(xiàn)較低,50℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值,水浴處理溫度超出50℃時(shí)酶活力逐漸變小。對(duì)于纖維素酶活的最適溫度為50℃,即纖維素酶產(chǎn)量的最適溫度在50℃。

      參考文獻(xiàn)

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      (責(zé)編:張宏民)

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