桂意云 陳忠良 秦翠鮮 汪淼 劉麗敏 李楊瑞 黃東亮

摘要：【目的】?jī)?yōu)化基于毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）技術(shù)的甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系，為甘蔗遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究、分子輔助育種及遺傳圖譜構(gòu)建提供技術(shù)支持。【方法】基于CGE技術(shù)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇dNTPs濃度、DNA聚合酶量、引物濃度和DNA模板量為考察因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳SSR-PCR反應(yīng)體系，并用于8個(gè)甘蔗種質(zhì)資源材料的遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】最佳SSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：dNTPs濃度0.15 mmol/L，DNA聚合酶1.5 U，引物濃度0.50 μmol/L，DNA模板量25 ng。利用該體系對(duì)8份來(lái)自不同國(guó)家地域的甘蔗種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)8對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出101個(gè)片段，其中多態(tài)性片段為93個(gè)，多態(tài)性比率為92.1%。聚類分析結(jié)果表明，參試材料間的遺傳相似性系數(shù)為0.521～0.871，在相似性系數(shù)為0.614處，所有參試材料可分為兩大類，3份國(guó)外種質(zhì)材料PINDAR、CP72-1210、CP84-1198與ROC20、GT69-156聚為一類；而ROC26、GT02-237和GT97-69聚為另一類?！窘Y(jié)論】基于CGE技術(shù)的SSR-PCR反應(yīng)體系檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用于甘蔗的遺傳分析及遺傳作圖。

關(guān)鍵詞： 甘蔗；SSR分子標(biāo)記；毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）；反應(yīng)體系；遺傳分析

中圖分類號(hào)： S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）09-1463-07

Abstract：【Objective】SSR-PCR reaction system of sugarcane based on capillary gel electrophoresis（CGE） technology was optimized to provide technical support for research on genetic diversity and genetic relationship， molecular-assisted breeding and genetic map construction of sugarcane. 【Method】Four factors affecting SSR-PCR were optimized by orthogonal exprement based on CGE technology， including dNTPs concentration， primer concentration， Taq DNA polymerase amount and DNA template amount. Then the optimal SSR-PCR reaction system was confirmed and applied to genetic analysis of 8 sugarcane germplasm resources. 【Result】The results showed that， the optimal reaction system（20 μL） was composed of 0.15 mmol/L dNTPs， 1.5 U Taq DNA polymerase， 0.50 μmol/L primers and 25 ng DNA templates. Using optimal reaction system and 8 pairs of SSR primers， a total of 101 fragments were amplified from 8 sugarcane germplasms of several countries， 93 of which was polymorphic， with a polymorphism rate of 92.1%. The cluster analysis showed that， coefficient of genetic similarity among 8 germplasms ranged from 0.521 to 0.871. All tested materials could be clustered into two groups at similarity coefficient of 0.614， three foreign germplasms viz.， PINDAR， CP72-1210， CP84-1198 and ROC20， GT69-156 were clustered into the same group， but ROC26， GT02-237 and GT97-69 were clustered into another group. 【Conclusion】The established SSR-CGE system is suitable for genetic diversity analysis and genetic mapping of sugarcane due to its stable detection result and good reproducibility.

Key words： sugarcane； SSR molecular marker； capillary gel electrophoresis（CGE）； reaction system； genetic analysis

0 引言

【研究意義】甘蔗是世界上重要的糖料和能源作物，我國(guó)甘蔗糖產(chǎn)量占全國(guó)食糖總產(chǎn)量的90%以上（李楊瑞和楊麗濤，2009）。甘蔗常規(guī)育種工作量大、育種周期長(zhǎng)、效率低，是當(dāng)前甘蔗育種面臨的共性問(wèn)題。由于SSR分子標(biāo)記具有數(shù)量多、多態(tài)性高、重復(fù)性好、遺傳上呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于作物輔助育種、生物遺傳學(xué)研究。對(duì)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與常規(guī)凝膠電泳檢測(cè)方法相比，毛細(xì)管凝膠電泳（Capillary gel electrophoresis，CGE）具有高靈敏度、高效率、高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)（Bor et al.，2003；郝晨陽(yáng)等，2005），可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子化合物的分離。因此，建立基于CGE技術(shù)的甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系可快速準(zhǔn)確鑒別甘蔗雜交后代，掌握甘蔗品種（系）間的遺傳多樣性與遺傳關(guān)系，對(duì)于加快甘蔗育種進(jìn)程具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有大量關(guān)于SSR熒光標(biāo)記CGE檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道。Huang等（2002）利用24對(duì)SSR熒光引物檢測(cè)了來(lái)自五大洲共68個(gè)國(guó)家的998份六倍體面包小麥，共檢測(cè)到470個(gè)等位基因，結(jié)果表明利用SSR熒光標(biāo)記可快速獲得用于種質(zhì)登記的高通量指紋數(shù)據(jù)及評(píng)估物種遺傳多樣性。張鳳娟（2004）利用SSR熒光標(biāo)記CGE技術(shù)對(duì)雜交水稻岡優(yōu)527進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)和純度鑒定。易紅梅等（2006）利用7對(duì)SSR熒光引物對(duì)192份玉米材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，CGE熒光檢測(cè)比常規(guī)變性PAGE銀染檢測(cè)更適用于高通量材料的檢測(cè)分析。梁俊等（2010）利用SSR熒光標(biāo)記CGE技術(shù)對(duì)甘蔗屬3個(gè)不同種的12個(gè)材料進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳關(guān)系分析。程本義等（2011）以16個(gè)雜交水稻不育系、恢復(fù)系及組合為材料，建立了SSR熒光標(biāo)記CGE檢測(cè)方法，可準(zhǔn)確讀出目標(biāo)DNA片段的大小，且檢測(cè)數(shù)據(jù)精確，與常規(guī)凝膠電泳檢測(cè)方法相比，其檢測(cè)效率更高。鄒麗梅等（2011）通過(guò)建立適用于玉米特定分離群體的高通量SSR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)180份玉米DH系材料進(jìn)行擴(kuò)增及電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)提高了玉米分子育種效率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然SSR熒光標(biāo)記CGE技術(shù)已成功應(yīng)用于水稻、小麥、玉米、甘蔗等作物遺傳分析研究，但不同物種使用不同的PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系的建立是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，反應(yīng)體系中的多個(gè)因子均會(huì)直接影響PCR擴(kuò)增效果及后續(xù)產(chǎn)物檢測(cè)準(zhǔn)確性，尤其甘蔗是異源多倍體植物，其基因組DNA較復(fù)雜，但目前鮮見(jiàn)基于CGE技術(shù)的甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立基于CGE技術(shù)的甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系，并用于甘蔗種質(zhì)資源遺傳分析，為甘蔗遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究、分子輔助育種及遺傳圖譜構(gòu)建等提供可靠、有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試甘蔗種質(zhì)材料為PINDAR、ROC26、ROC20、CP72-1210、CP84-1198、GT02-237、GT97-69和GT69-

156，均采集自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所甘蔗資源圃；DNA聚合酶、dNTPs、SLS（上樣緩沖液，甲酰胺）、Genescan-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和PAGE膠柱等購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 總DNA提取

采用SDS法提取甘蔗總DNA（陳忠良等，2010；黃東亮等，2010）：①取100 mg甘蔗嫩葉加入液氮于研缽中快速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管，加入800 μL DNA抽提緩沖液，搖勻，65 ℃水浴40 min。②加入200 μL 5 mol/L KAc（pH 5.2）充分混勻，冰浴12 min，4 ℃下10000 r/min離心15 min，取上清液加入等體積酚/氯仿、氯仿各抽提1次，12000 r/min離心10 min。③上清液加入1/10體積3 mol/L NaAc（pH 4.8）和2倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃靜置30 min沉淀DNA，再于4 ℃下10000 r/min離心10 min，棄上清液，用72%乙醇漂洗3次，晾干后加入100 μL TE溶解。④加入RNaseA至終濃度50 μg/mL，37 ℃水浴30 min。最后取2 μL總DNA液于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 SSR引物篩選及合成

通過(guò)常規(guī)PAGE技術(shù)篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的SSR引物，然后合成熒光引物（正向引物序列5′端加入CY5熒光分子信標(biāo)，反向引物為常規(guī)合成），再進(jìn)行SSR熒光引物篩選（Cordeiro et al.，2001；Pan et al.，2007）。

1. 4 SSR-PCR反應(yīng)體系的建立

以甘蔗ROC26的總DNA為模板，SMC336BS為引物，反應(yīng)體系20 μL，每處理重復(fù)2次。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45），選擇dNTPs（含Mg2+）濃度、DNA聚合酶量、引物濃度和DNA模板量為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)4個(gè)水平（表1）。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，退火1 min（退火溫度采用梯度PCR進(jìn)行篩選），72 ℃ 50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min（陳忠良等，2010）。最后對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果依次打分（韓國(guó)輝等，2011）。

1. 5 PCR產(chǎn)物的CGE檢測(cè)

利用BECKMAN COULTER CEQ 8000系統(tǒng)遺傳分析儀對(duì)熒光SSR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行CGE檢測(cè)。每個(gè)上樣孔的上樣體系：20.0 μL SLS，0.1 μL Genescan-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)，1.0 μL稀釋200倍的PCR產(chǎn)物。電泳分離程序：90 ℃變性2 min；進(jìn)樣電壓2.0 kV，時(shí)間30 s；分離電壓7.5 kV，時(shí)間40 min，保存樣本信息。

1. 6 數(shù)據(jù)處理分析

利用GeneMapper-v3.0對(duì)遺傳分析系統(tǒng)儀收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（Levinson and Gutman，1987；Clark，1988；Schlotterer and Tautz，1992）。將SSR標(biāo)記片段與Genescan-500分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到SSR標(biāo)記片段長(zhǎng)度。對(duì)信號(hào)穩(wěn)定且易于判讀的峰高采用“0-1”系統(tǒng)記錄其位置，在相同的片段大小位置有峰高記為“1”，無(wú)峰高則記為“0”，建立甘蔗SSR標(biāo)記的0、1數(shù)據(jù)矩陣。最后利用NTSYS-pc 2.1，結(jié)合UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 甘蔗總DNA提取結(jié)果

0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，提取的DNA樣品條帶明亮、清晰、完整，無(wú)拖尾現(xiàn)象，無(wú)明顯RNA帶，且點(diǎn)樣孔下端干凈不發(fā)亮，表明DNA未降解，純度較高，蛋白質(zhì)和RNA等雜質(zhì)去除較徹底。經(jīng)測(cè)定，OD260/OD280為1.76～1.87，OD260/OD230為1.89～2.07，表明提取的甘蔗總DNA質(zhì)量較好，可用于SSR分子標(biāo)記分析。

2. 2 PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)L16（45）結(jié)果如圖2所示，16個(gè)組合的PCR產(chǎn)物均能檢測(cè)到目標(biāo)峰高信號(hào)，組合15的峰高最多、信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定；dNTPs濃度和DNA聚合酶量過(guò)低均會(huì)影響PCR產(chǎn)物生成，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)弱、峰高數(shù)少（擴(kuò)增片段少）；DNA聚合酶量和引物濃度過(guò)高會(huì)造成非特異性片段生成，檢測(cè)到雜峰，影響目標(biāo)峰高的判讀。

PCR擴(kuò)增結(jié)果得分如表2所示，目標(biāo)峰高信號(hào)強(qiáng)、峰高數(shù)量多、穩(wěn)定且易讀取的最佳產(chǎn)物記16分，最差的記1分。對(duì)其進(jìn)行直觀分析，由于極差（R）大小能反映各因素對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響程度，正交設(shè)計(jì)的4個(gè)因素對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響排序依次為dNTPs濃度>DNA聚合酶>DNA模板量>引物濃度。根據(jù)各因素水平下的得分平均值（K）可初步確定最佳反應(yīng)體系（20 μL）：dNTPs 0.15 mmol/L，DNA聚合酶1.5 U，引物濃度0.50 μmol/L，DNA模板25 ng。這個(gè)體系與組合12（評(píng)分15分）最接近，僅DNA聚合酶用量有所不同。

2. 3 基于CGE技術(shù)的甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系建立

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，采用最佳SSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：dNTPs濃度0.15 mmol/L，DNA聚合酶1.5 U，引物濃度0.50 μmol/L，DNA模板量25 ng，用2對(duì)SSR熒光引物（SMC336BS和mSSCIR43）分別對(duì)2份甘蔗總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，所選用引物對(duì)的PCR產(chǎn)物檢測(cè)圖譜出峰有序、信號(hào)強(qiáng)、條帶峰單一、雜峰較少、重復(fù)性好，表明建立的基于CGE技術(shù)SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。

2. 4 甘蔗種質(zhì)資源遺傳分析結(jié)果

利用基于CGE技術(shù)的SSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)8份甘蔗種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，8對(duì)引物共擴(kuò)增出101個(gè)片段（表3），擴(kuò)增片段在90～255 bp，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出12.6個(gè)片段，其中多態(tài)性片段93個(gè)，多態(tài)性比率為92.1%。引物SMC16SA擴(kuò)增的片段最多，為16個(gè)；引物SMC336BS擴(kuò)增片段最少，為10個(gè)，但其在ROC20和ROC26各擴(kuò)增出1個(gè)能區(qū)別于其他甘蔗品種的特異片段，大小分別為169（圖4-c）和184 bp（圖4-b）；引物mSSCIR43則從ROC20、ROC26和CP84-1198各擴(kuò)增出1個(gè)能區(qū)別于其他甘蔗種質(zhì)材料的特異片段，大小分別為232、234和247 bp。其中，SMC336BS和mSSCIR43的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、穩(wěn)定、峰高單一、雜峰較少、區(qū)分度高，可將8份甘蔗種質(zhì)材料有效區(qū)分，故用雙引物組合產(chǎn)生的分子數(shù)據(jù)可用于DNA指紋身份證構(gòu)建（圖5）。

聚類分析結(jié)果如圖6所示，8份甘蔗種質(zhì)材料間的相似性系數(shù)平均值為0.657，CP84-1198和GT69-156的相似性系數(shù)最大，為0.871；PINDAR和ROC26的相似性系數(shù)最小，為0.521。在相似性系數(shù)0.614處，所有參試材料可分為兩大類，3份國(guó)外種質(zhì)材料PINDAR、CP72-1210、CP84-1198與ROC20、GT69-156聚為一類；而ROC26、GT02-237和GT97-69聚為另一類。3份桂糖種質(zhì)材料（GT02-237、GT97-69和GT69-156）未聚在同一類，可能與其父母本親緣關(guān)系有關(guān)。這說(shuō)明8份甘蔗種質(zhì)材料有豐富的遺傳多樣性，且建立的SSR- CGE技術(shù)體系檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用于甘蔗的遺傳分析及遺傳作圖。

3 討論

基于CGE熒光檢測(cè)系統(tǒng)建立的DNA自動(dòng)分析技術(shù)，灌膠、上樣、片段分離和數(shù)據(jù)收集均自動(dòng)完成，電泳檢測(cè)時(shí)各樣品中均加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)，可直接精確獲得各泳道DNA片段的大小，區(qū)分度達(dá)1 bp，該技術(shù)具有高通量、高效率、高精確性等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于大規(guī)模材料的分析研究。Bor等（2003）僅用50 h就完成了198份樣品約1000個(gè)位點(diǎn)的CGE熒光檢測(cè)分析。郝晨陽(yáng)等（2005）對(duì)5000份北方冬小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，除去儀器損耗成本，多重PCR-SSR熒光標(biāo)記分析技術(shù)和常規(guī)的變性PAGE銀染技術(shù)的使用經(jīng)費(fèi)基本持平，但前者的效率顯著高于后者。本研究中SSR熒光引物合成的成本約800元1對(duì)引物（2OD），保存年限為2年，其成本遠(yuǎn)高于普通引物的合成。常規(guī)的變性PAGE銀染技術(shù)所需成本較低，一般的實(shí)驗(yàn)室就能完成，在分析較少的材料和位點(diǎn)時(shí)，是一套經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)技術(shù)，但人工讀取膠板工作繁瑣，且存在一定的人為誤差。因此，建議先運(yùn)用常規(guī)的變性PAGE銀染檢測(cè)法對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，再對(duì)篩選出的引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，并進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增分析；將變性PAGE銀染檢測(cè)法與CGE熒光檢測(cè)法有效結(jié)合起來(lái)完成試驗(yàn)材料的檢測(cè)分析，可節(jié)省費(fèi)用，同時(shí)提高工作效率。因此，SSR熒光標(biāo)記CGE技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，為作物的分子輔助育種研究提供了有力的技術(shù)支持。

通過(guò)SSR熒光標(biāo)記與CGE檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)SSR分子標(biāo)記的自動(dòng)化分析，而確立SSR-PCR反應(yīng)最佳體系是實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析的前提。反應(yīng)體系中各組分的含量均可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增的特異性、敏感性及產(chǎn)物的產(chǎn)量等。因此，本研究采用具有均衡分散性和整齊可比性的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)行多因素聯(lián)合優(yōu)化方法對(duì)甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、DNA聚合酶量、引物濃度和DNA模板量進(jìn)行優(yōu)化，篩選各因素的最佳水平，獲得最優(yōu)水平組合，最終確立最佳PCR反應(yīng)體系，并通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)和8對(duì)SSR引物對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明所建立的SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。利用該SSR-PCR反應(yīng)體系和8對(duì)SSR引物對(duì)8份來(lái)自不同國(guó)家地區(qū)的甘蔗種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，并選用2對(duì)引物聯(lián)合進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，結(jié)果表明SSR位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高，且穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好，為甘蔗種質(zhì)資源遺傳分析和遺傳作圖構(gòu)建等提供了有效的技術(shù)支持。

4 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，建立了基于CGE技術(shù)的甘蔗SSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：dNTPs濃度0.15 mmol/L，DNA聚合酶1.5 U，引物濃度0.50 μmol/L，DNA模板量25 ng。利用該體系對(duì)甘蔗種質(zhì)材料進(jìn)行檢測(cè)分析，其結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，適合甘蔗的遺傳分析及遺傳作圖。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）