上饒?jiān)缋嬷髟云贩N離體快繁體系的建立

夏華炎 徐路 肖虹 尹明華 洪森榮

摘要：【目的】建立上饒?jiān)缋嬷髟云贩N六月雪和黃皮消的離體快繁技術(shù)體系，為上饒?jiān)缋嬖嚬苊绲目焖俜敝程峁﹨⒖家罁?jù)?！痉椒ā繉α卵┖忘S皮消進(jìn)行組織培養(yǎng)，篩選適宜的外植體、滅菌方式、培養(yǎng)基和移栽基質(zhì)。【結(jié)果】六月雪和黃皮消理想的外植體為長7.0～8.0 cm的新生幼嫩帶芽莖段，理想的滅菌方式為75%酒精消毒1.0 min+0.1%氯化汞消毒10～12 min，理想的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，理想的不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA，繁殖系數(shù)為3.6～3.8，理想的不定芽生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L PP333+0.5 g/L AC（活性炭），理想的試管苗移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖∶蛭石=4∶1∶1或腐殖土∶珍珠巖=5∶1，移栽后澆灌含0.5 mg/L PP333的MS基本培養(yǎng)液可顯著提高試管苗成活率（P<0.05），馴化移栽成活率在90.0%以上?！窘Y(jié)論】建立的六月雪和黃皮消離體快繁體系，可供上饒?jiān)缋娼M培苗工廠化生產(chǎn)參考利用。

關(guān)鍵詞： 上饒?jiān)缋?；主栽品種；離體快繁體系

中圖分類號(hào)： S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）09-1547-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish in vitro rapid propagation system of main cultivars of Shangrao early pear namely Liuyuexue and Huangpixiao， in order to provide reference for rapid propagation of test-tube plantlet of Shangrao early pear. 【Method】Tissue culture of Liuyuexue and Huangpixiao was conducted， suitable explants， disinfection method， culture medium and transplanting matrices were selected. 【Result】Results showed that ideal explant of Liuyuexue and Huangpixiao was new young stems with buds of 7.0-8.0 cm in length； ideal disinfection method was 75% alcohol for 1.0 min+0.1% mercuric chloride for 10-12 min； ideal axillary bud induction medium was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA； ideal adventitious bud proliferation culture medium was MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA with coefficient being 3.6-3.8； ideal adventitious buds rooting culture medium was 1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L PP333+0.5 g/L AC（active carbon）， ideal transplanting matrix of plantlets was peat∶perlite∶vermiculite=4∶1∶1 or humus soil∶perlite=5∶1. After transplanting， watering MS culture fluid containing 0.5 mg/L PP333 could significantly improve survival rate of plantlets（P<0.05），which was up to 90.0%. 【Conclusion】The established in vitro rapid propagation system of Liuyuexue and Huangpixiao can provide reference for factory production of tissue culture seedling of Shangrao early pear.

Key words： Shangrao early pear； main cultivar； in vitro rapid propagation system

0 引言

【研究意義】上饒?jiān)缋媸墙魇∩橡埧h地方早熟梨品種，也是我國早熟梨種質(zhì)資源中的特有種質(zhì)，果大皮薄，色白光滑，肉質(zhì)細(xì)嫩，汁多渣少，味甜微酸，酥脆可口，抗氧化性強(qiáng)，去皮或切開后過夜不黃。上饒?jiān)缋婧扇苄怨绦挝?3.7%、糖11.2%、酸0.82%，具有生津潤肺、清熱化痰、解熱消暑等功效，既是夏令佳品，又是中成藥雪梨膏的最佳原料（胡正月等，2000）。近年來，由于上饒?jiān)缋嫔a(chǎn)、包裝成本較高，農(nóng)民的生產(chǎn)積極性受到影響，致使栽培管理粗放，樹形雜亂（周愛賢和蔣群華，2014），樹勢老化，病蟲為害嚴(yán)重，對江西省果業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了不利影響。實(shí)際生產(chǎn)中，上饒?jiān)缋嬷饕ㄟ^嫁接繁殖（周愛賢和蔣群華，2014），存在育種周期長、繁殖系數(shù)低、成本高、品種易退化等缺點(diǎn)，而采用組織培養(yǎng)方法對上饒?jiān)缋嬷髟云贩N進(jìn)行離體快繁，可克服以上缺點(diǎn)。因此，開展上饒?jiān)缋嬷髟云贩N離體快繁技術(shù)研究，對其種質(zhì)保存、抗性育種和種苗工廠化生產(chǎn)均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】關(guān)于梨不同品種離體快繁技術(shù)研究的報(bào)道較多，如何志祥等（2006）對翠冠梨、王震星等（2006）對西洋梨莖段離體培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)進(jìn)行了探討；楊青松等（2008）通過正交試驗(yàn)篩選出AS+1.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+ 0.2 mg/L GA3為金水2號(hào)梨莖段增殖的理想培養(yǎng)基；蘇艷麗等（2010）對影響紅星梨莖段離體快繁的因素進(jìn)行了篩選；李嫦艷和吳翠云（2011）、蔡小東和李志保（2011）分別對新梨七號(hào)和黃花梨莖段離體快繁及其植株再生進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和研究；宋健坤等（2014）以梨砧木OH×F51為試材，利用其莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)及利用葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，獲得了OH×F51離體培養(yǎng)的最佳途徑；唐軍榮等（2015）采用無籽刺梨嫩枝莖段為外植體進(jìn)行離體快繁技術(shù)研究獲得了較好的效果；趙雪慧等（2015）以無子刺梨去葉片及皮刺的健壯枝條為外植體，摸索總結(jié)出無子刺梨組織培養(yǎng)和快速繁殖各階段的最佳配方。【本研究切入點(diǎn)】目前，對上饒?jiān)缋娴难芯恐饕性趦?yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)示范（鄭亞東等，1999）、產(chǎn)業(yè)發(fā)展（周愛賢和蔣群華，2014）和保鮮（徐芬芬等，2015）等方面，關(guān)于上饒?jiān)缋娼M織培養(yǎng)方面的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立上饒?jiān)缋嬷髟云贩N六月雪和黃皮消帶芽莖段的無菌體系，探究影響其離體快繁效率的因素，篩選出穩(wěn)定高效的組織培養(yǎng)體系，為上饒?jiān)缋娣N質(zhì)保存和種苗快速繁殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試品種為江西省上饒縣地方早熟梨六月雪和黃皮消，其外植體（枝條）采集于江西上饒縣花廳鎮(zhèn)毛家村。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體選取 選取六月雪和黃皮消新生幼嫩枝條及1年生枝條，用于建立無菌體系。

1. 2. 2 帶芽莖段處理 1年生枝條剪成長1.0～1.5 cm（含1個(gè)腋芽）及長7.0～8.0 cm的帶芽莖段（含4～5個(gè)腋芽）兩種規(guī)格外殖體，新生幼嫩枝條自葉基部剪去葉片（保留葉柄）后剪成與1年生枝條長度相同的帶芽莖段。兩種類型的帶芽莖段隨即放入1000 mL燒杯中，用飽和洗衣粉浸泡20 min，隨后用自來水沖洗5次，再帶至超凈工作臺(tái)進(jìn)行滅菌處理。設(shè)①75%酒精消毒1 min+ 10%次氯酸鈉消毒10～12 min、②75%酒精消毒1 min+ 10%次氯酸鈉消毒18～20 min、③75%酒精消毒1 min+ 0.1%氯化汞消毒10～12 min、④75%酒精消毒1 min+ 0.1%氯化汞消毒18～20 min 4種消毒方式。消毒后均用無菌水沖洗3次。

兩種類型的帶芽莖段消毒后均用無菌濾紙吸干水分，切去兩端，接種于MS固體基本培養(yǎng)基上。接種后每天觀察帶芽莖段的污染情況和死亡情況，20 d后統(tǒng)計(jì)帶芽莖段的污染率和死亡率。

污染率（%）=污染的帶芽莖段數(shù)/接種的帶芽莖段總數(shù)×100

死亡率（%）=死亡的帶芽莖段數(shù)/接種的帶芽莖段總數(shù)×100

1. 2. 3 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 將1.2.2中最佳滅菌方式獲得的外植體接種至腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)。腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、2.0 mg/L 6-BA及0.1、0.2、0.5 mg/L IBA，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為9種培養(yǎng)基。接種后每天記錄帶芽莖段腋芽誘導(dǎo)出芽時(shí)間和數(shù)量，60 d后分別統(tǒng)計(jì)六月雪和黃皮消在9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的腋芽誘導(dǎo)出芽時(shí)間和數(shù)量，篩選適宜的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1. 2. 4 不定芽增殖培養(yǎng)基篩選 將1.2.3中適宜培養(yǎng)基上誘導(dǎo)獲得的腋芽完整切下，切去頂部后，接種于不定芽增值培養(yǎng)基上。不定芽增值培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、2.0 mg/L KT及0.1、0.2、0.5 mg/L NAA，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為9種培養(yǎng)基。接種后每天記錄不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量，60 d后分別統(tǒng)計(jì)六月雪和黃皮消在9種增殖培養(yǎng)基上的不定芽誘導(dǎo)數(shù)量，篩選適宜的增殖培養(yǎng)基。

1. 2. 5 不定芽生根培養(yǎng)基篩選 將1.2.4中適宜增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)獲得的不定芽進(jìn)行分離，分別接種于5種不定芽生根培養(yǎng)基上。5種不定芽生根培養(yǎng)基為：①1/2MS（CK）；②1/2MS+0.1 mg/L NAA；③1/2MS+0.3 mg/L NAA；④1/2MS+0.5 mg/L NAA；⑤1/2MS+1.0 mg/L NAA。接種后每天觀察生根數(shù)和根長，60 d后統(tǒng)計(jì)平均生根數(shù)和平均根長，篩選出較佳的生根培養(yǎng)基，然后在該培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加：①0.3 mg/L PP333；②0.5 g/L AC（活性炭）；③0.3 mg/L PP333+0.5 g/L AC，每天繼續(xù)觀察生根情況，60 d后統(tǒng)計(jì)平均生根數(shù)和平均根長。

1. 2. 6 試管苗的移栽馴化 將1.2.5中生根數(shù)達(dá)4條以上的試管苗打開封口膜，在培養(yǎng)架上放置4～5 d后，將試管苗取出，在水池中小心洗去根部的瓊脂和培養(yǎng)基，用0.5%多菌靈液噴灑幼苗，然后移栽至預(yù)先用 0.1%高錳酸鉀消毒過的基質(zhì)中。設(shè)3種移栽基質(zhì)，即①泥炭∶珍珠巖∶蛭石=4∶1∶1、②沙∶紅土=1∶1和③腐殖土∶珍珠巖=5∶1。移栽后每天早晚各澆灌1次添加0.5 mg/L PP333的MS基本培養(yǎng)液。30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。以試管苗萎蔫、葉片變黃枯死確定為死亡，長出新葉確定為成活。

成活率（%）=成活的試管苗數(shù)/移栽的試管苗總數(shù)×100

以上試驗(yàn)3次重復(fù)，取平均值；每種培養(yǎng)基均添加30.0 g/L蔗糖和5.0 g/L瓊脂粉。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 外植體及其滅菌方式的篩選結(jié)果

由表1可知，滅菌方式①和②的新生幼嫩帶芽莖段及1年生帶芽莖段的污染率均較高，但差異不顯著（P>0.05，下同），其中新生幼嫩帶芽莖段的污染率明顯低于1年生帶芽莖段；滅菌方式③和④的新生幼嫩帶芽莖段及1年生帶芽莖段的污染率均較低，顯著低于滅菌方式①和②（P<0.05，下同），其中滅菌方式④的污染率顯著低于滅菌方式③，新生幼嫩帶芽莖段的污染率明顯低于1年生帶芽莖段；滅菌方式④兩種規(guī)格外植體的1年生帶芽莖段污染率分別為41.8%和45.9%，其消毒效果與新生幼嫩帶芽莖段滅菌方式③的消毒效果相當(dāng)。

由表1還可知，4種滅菌方式的新生幼嫩帶芽莖段均有變黑死亡現(xiàn)象（死亡率18.5%～78.9%），其中，滅菌方式④兩種規(guī)格帶芽莖段的死亡率均最高，顯著高于滅菌方式③，二者顯著高于滅菌方式①和②。4種滅菌方式的1年生7.0～8.0 cm帶芽莖段均無變黑死亡現(xiàn)象（死亡率為0），1.0～1.5 cm帶芽莖段的變黑死亡率較低，為8.5%～27.8%，其中，以滅菌方式③和④的死亡率顯著高于滅菌方式①和②，滅菌方式①和②的死亡率差異不顯著，而滅菌方式③和④的死亡率差異顯著。

綜上所述，建立上饒?jiān)缋嬷髟云贩N六月雪和黃皮消無菌體系的外植體可選用長7.0～8.0 cm的新生幼嫩帶芽莖段，滅菌方式以75%酒精消毒1 min+0.1%氯化汞消毒10～12 min為宜。

2. 2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

由表2可知，六月雪和黃皮消帶芽莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基③、⑤、⑥和⑨上誘導(dǎo)出芽時(shí)間為23～27 d，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基①、②、④、⑦、⑧上誘導(dǎo)出芽時(shí)間僅為14～17 d，顯著早于誘導(dǎo)培養(yǎng)基③、⑤、⑥和⑨。

從表2還可看出，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基①、②、③、④、⑥、⑦和⑨上，六月雪和黃皮消帶芽莖段誘導(dǎo)出腋芽數(shù)為1.5～3.3個(gè)，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基⑤和⑧上誘導(dǎo)出腋芽數(shù)為4.3～4.8個(gè)，顯著多于誘導(dǎo)培養(yǎng)基①、②、③、④、⑥、⑦和⑨?？紤]到誘導(dǎo)培養(yǎng)基⑤的誘導(dǎo)出芽時(shí)間偏晚（25 d），因此，確定誘導(dǎo)培養(yǎng)基⑧即MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA為新生幼嫩帶芽莖段理想的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2. 3 不定芽增殖培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

從圖1可以看出，六月雪和黃皮消在增殖培養(yǎng)基①、②、③、④、⑥、⑦、⑧和⑨上的不定芽數(shù)為1.1～2.4個(gè)，顯著低于增殖培養(yǎng)基⑤上的不定芽數(shù)（3.6～3.8個(gè)）。因此，確定增殖培養(yǎng)基⑤即MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA為六月雪和黃皮消理想的不定芽增殖培養(yǎng)基。

2. 4 不定芽生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

由表3可知，六月雪和黃皮消在生根培養(yǎng)基③上的平均根數(shù)最多、平均根長最長，其中平均根數(shù)與生根培養(yǎng)基①、②、④和⑤差異顯著，平均根長顯著長于生根培養(yǎng)基①、②和⑤。因此，確定生根培養(yǎng)基③即1/2MS+0.3 mg/L NAA為六月雪和黃皮消不定芽理想的生根培養(yǎng)基。

由表4可知，在生根培養(yǎng)基③的基礎(chǔ)上添加0.3 mg/L PP333或0.5 g/L AC均能顯著增加六月雪和黃皮消不定芽生根數(shù)量；添加0.5 g/L AC對六月雪和黃皮消不定芽的根長無顯著影響，而添加0.3 mg/L PP333可使六月雪和黃皮消不定芽的根長顯著變短，使其變粗；在生根培養(yǎng)基③的基礎(chǔ)上同時(shí)添加0.3 mg/L PP333和0.5 g/L AC，可顯著增加六月雪和黃皮消不定芽的生根數(shù)，顯著縮短其根長。綜上所述，1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L PP333+0.5 g/L AC是六月雪和黃皮消不定芽理想的生根培養(yǎng)基。

2. 5 試管苗移栽基質(zhì)的篩選結(jié)果

從圖2可看出，與移栽基質(zhì)沙∶紅土=1∶1相比，移栽基質(zhì)泥炭∶珍珠巖∶蛭石=4∶1∶1和腐殖土∶珍珠巖=5∶1可顯著提高六月雪和黃皮消試管苗的移栽成活率。因此，確定六月雪和黃皮消試管苗理想的移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖∶蛭石=4∶1∶1或腐殖土∶珍珠巖=5∶1。

3 討論

目前，對翠冠梨（何志祥等，2006）、西洋梨（王震星等，2006）、紅星梨（蘇艷麗等，2010）、黃花梨（蔡小東和李志保，2011）及新梨七號(hào)（李嫦艷和吳翠云，2011）莖段組織培養(yǎng)的研究已有報(bào)道，且有芽莖段培養(yǎng)較無芽莖段培養(yǎng)更易獲得成功（李嫦艷和吳翠云，2011），帶芽莖段是植物組織培養(yǎng)較理想的外植體（朱啟發(fā)和朱亞雄，2015）。本研究利用上饒?jiān)缋媪卵┖忘S皮消新生幼嫩枝條及1年生枝條帶芽莖段為外植體開展組織培養(yǎng)，建立了上饒?jiān)缋嬷髟云贩N的離體快繁體系，可供上饒?jiān)缋嬖嚬苊缈焖俜敝硡⒖祭谩?/p>

在梨帶芽莖段離體快繁的外植體滅菌階段，一般首先剪取較長的枝條進(jìn)行消毒后再切成較短的帶芽莖段，以防幼嫩的帶芽莖段變黑損傷，而消毒時(shí)間的選擇因品種而異（何志祥等，2006；王震星等，2006；張玉嬌等，2009；蘇艷麗等，2010；蔡小東和李志保，2011；唐軍榮等，2015）。本研究中用于建立上饒?jiān)缋嬷髟云贩N無菌體系的外植體為長7.0～8.0 cm的新生幼嫩帶芽莖段，且可直接接種，理想的滅菌方式為75%酒精消毒1.0 min+0.1%氯化汞消毒10～12 min，與蔡小東和李志保（2011）對黃花梨離體快繁的研究結(jié)果一致。

本研究中上饒?jiān)缋嬷髟云贩N六月雪和黃皮消當(dāng)年生幼嫩帶芽莖段理想的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，理想的不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA，與張玉嬌等（2009）對黃冠梨的研究結(jié)果一致，與何志祥等（2006）、蔡小東和李志保（2011）對翠冠梨和黃花梨的研究結(jié)果相似，表明在早熟梨、黃冠梨、翠冠梨和黃花梨的帶芽莖段組織培養(yǎng)中，需用高濃度的細(xì)胞分裂素與低濃度的生長素進(jìn)行組合誘導(dǎo)腋芽，不定芽誘導(dǎo)則需將細(xì)胞分裂素的濃度適當(dāng)降低。

唐軍榮等（2015）研究認(rèn)為，無籽刺梨生根時(shí)需將MS中的大量元素減半，在1/2MS+0.3 mg/L IBA上進(jìn)行生根培養(yǎng)效果較佳，不定芽生根率達(dá)100.0%，本研究理想的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/L NAA，不定芽生根率為92.8%。李嫦艷和吳翠云（2011）研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行新梨七號(hào)生根培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中添加的大量元素及蔗糖均需減半，其最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+

2.5 mg/L IBA+15.0 g/L蔗糖，生根率為90.0%，本研究結(jié)果與其不同，理想的生根培養(yǎng)基蔗糖添加量無需減半，生根率仍高達(dá)92.8%，具體原因有待進(jìn)一步探討。

本研究中六月雪和黃皮消試管苗理想的移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖∶蛭石=4∶1∶1或腐殖土∶珍珠巖=5∶1，與唐軍榮等（2015）對無籽刺梨的研究結(jié)果一致，但與李嫦艷和吳翠云（2011）對新梨七號(hào)的研究結(jié)果不一致，認(rèn)為新梨七號(hào)試管苗在珍珠巖∶土壤=1∶1、沙子∶土壤=

1∶1和蛭石∶土壤=1∶1中成活率均很高，從節(jié)約成本方面考慮，移栽基質(zhì)以蛭石和土壤（1∶1）為最佳，并強(qiáng)調(diào)基質(zhì)營養(yǎng)充分是提高移栽成活率的重要措施。

4 結(jié)論

本研究建立了上饒?jiān)缋嬷髟云贩N六月雪和黃皮消的離體快繁體系，即建立無菌體系的外植體可選用長7.0～8.0 cm新生幼嫩帶芽莖段，滅菌方式為75%酒精消毒1.0 min+0.1%氯化汞消毒10～12 min，腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L PP333+0.5 g/L AC，移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖∶蛭石=4∶1∶1或腐殖土∶珍珠巖=5∶1，移栽后澆灌含0.5 mg/L PP333的MS基本培養(yǎng)液，馴化移栽成活率在90.0%以上。該離體快繁體系可供上饒?jiān)缋娼M培苗工廠化生產(chǎn)參考利用。

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（責(zé)任編輯 思利華）