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      龍眼多糖樹(shù)脂脫色除蛋白工藝優(yōu)化

      2016-05-30 17:01:29藍(lán)海波溫亞洲楊光美李武
      熱帶作物學(xué)報(bào) 2016年8期
      關(guān)鍵詞:工藝優(yōu)化龍眼多糖

      藍(lán)海波 溫亞洲 楊光美 李武

      摘 要 評(píng)價(jià)了7種樹(shù)脂對(duì)龍眼多糖脫色除蛋白的效果和多糖保留率的影響,篩選弱堿性離子大孔樹(shù)脂D301-R為最優(yōu)樹(shù)脂用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用單因素和Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)D301-R脫色除蛋白工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。確定其最佳工藝條件為:樹(shù)脂用量0.61 g/mL,溫度48 ℃,pH5.0,時(shí)間2.0 h。在此工藝條件下,其脫色率為75.32%,蛋白去除率為91.83%,多糖保留率為93.37%。

      關(guān)鍵詞 龍眼;多糖;大孔樹(shù)脂;脫色除蛋白;工藝優(yōu)化

      中圖分類(lèi)號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

      Abstract The effects of seven resins on the deproteination and decolorization in purifying longan polysaccharide were studied. The results showed that D301-R was better than the other six resins in protein and color removal. Deproteination and decolorization experiments were carried out by single experiments and the Box-Behnken response surface methodology(RSM)experiment. The optimum technological conditions are as follows: liquid/solid ratio 0.61 g/mL, temperature 48 ℃, pH5.0 and time 2.0 h. Under the conditions the polysaccharide retention, the decolorization rate and the deproteinization rate was 93.37%, 75.32% and 91.83%, respectively.

      Key words Longan; Polysaccharides; Macroporous resin; Decoloration and deproteinization; Optimization

      doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.019

      龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是我國(guó)南方特色水果,其營(yíng)養(yǎng)豐富,具有良好的保健功效[1]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),龍眼多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)肝臟等多種活性作用[2]。

      龍眼果肉含糖量高,不同品種和產(chǎn)地的龍眼干肉多糖含量在16%~25%之間[3-4]。龍眼經(jīng)提取獲得的粗多糖除含有糖類(lèi)物質(zhì)外,還含有少量的蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)。目前通常采用Sevag法或TCA法對(duì)多糖中的蛋白質(zhì)進(jìn)行去除[5],再通過(guò)活性炭吸附、H2O2脫色和透析等方法除去其中的色素等雜質(zhì)[6]。這些脫色除蛋白的方法操作較為繁瑣、多糖損失量大,且不適宜食品級(jí)多糖的生產(chǎn)。

      大孔樹(shù)脂是一類(lèi)具有多孔骨架結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物,可以通過(guò)吸附或離子交換作用對(duì)有機(jī)物進(jìn)行分離、除雜和濃縮[7]。大孔樹(shù)脂已被應(yīng)用于木糖等單糖的生產(chǎn)純化過(guò)程[8-9]。馮思欣等[10]采用D152樹(shù)脂對(duì)板藍(lán)根多糖進(jìn)行脫色,獲得了較高的多糖保留率(95%)。王雪艷[11]比較了5種大孔樹(shù)脂和雙氧水、活性炭對(duì)龍眼多糖的脫色效果,發(fā)現(xiàn)大孔樹(shù)脂XDA-1對(duì)龍眼多糖脫色效果較好,但其多糖保留率較低(81.55%),且未對(duì)其蛋白去除效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。易陽(yáng)等[12]采用大孔樹(shù)脂對(duì)龍眼多糖進(jìn)行脫色除蛋白,取得了較好的效果,其多糖保留率達(dá)到85%。本研究通過(guò)大孔樹(shù)脂的篩選,確定龍眼多糖脫色除蛋白的理想樹(shù)脂,并采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定其最佳脫色除蛋白工藝條件,旨在為龍眼多糖的研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 材料與試劑 龍眼干,經(jīng)鮮龍眼(品種“儲(chǔ)良”)去皮、去核65 ℃鼓風(fēng)干燥制得,其含水量為11.4%。

      大孔弱堿性離子交換樹(shù)脂(D301-R、D296)、大孔強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂(D001×7)、大孔強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂(D280)、大孔吸附樹(shù)脂(D3520、NKA-9、HPD-100)購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)樹(shù)脂有限公司。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

      1.1.2 儀器與設(shè)備 RHBASIC-II型磁力攪拌器,德國(guó)IKA公司;FSH-2A型打漿機(jī),金壇市水北康輝實(shí)驗(yàn)儀器廠;SHZ-A水浴震蕩器,金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠;2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司;R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申生儀器有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 多糖的提取 采用熱水浸提法:龍眼干60 ℃熱水浸泡20 min后打漿,料液比1 ∶ 30,80 ℃水浴浸提2.0 h,200目紗布過(guò)濾,20倍濃縮,離心(5 000 ×g;15 min)去沉淀,得龍眼粗多糖溶液。

      1.2.2 分析方法 多糖保留率的測(cè)定:總糖測(cè)定采用苯酚硫酸法[13]。還原糖測(cè)定采用3,5二硝基水楊酸法[14]。多糖含量=總糖含量-還原糖含量。多糖保留率=(MHZ-MHH)/(MQZ-MQH)×100%,式中MQZ和MHZ分別為吸附前后的總糖總量,MQH和MHH分別為吸附前后提取液中還原糖總量。

      蛋白去除率的測(cè)定:蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定[15]。蛋白去除率=(M′Q-M′H)/M′Q×100%,式中M′Q和M′H分別為吸附前后的蛋白質(zhì)含量。

      脫色率測(cè)定:多糖溶液調(diào)節(jié)至pH(6.5±0.1),8 000 ×g離心15 min后過(guò)濾,420 nm處測(cè)定OD值。脫色率=(OD前-OD后)/OD前×100%,式中OD前和OD后分別為脫色前后溶液的光密度值。

      1.2.3 大孔樹(shù)脂脫色除蛋白效果評(píng)價(jià) 分別對(duì)大孔樹(shù)脂吸附前后的脫色率、多糖保留率、蛋白去除率3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和,其權(quán)重系數(shù)分別為0.3、0.4和0.3。依據(jù)公式:u=0.3x+0.4y+0.3z計(jì)算評(píng)分。

      式中x表示脫色率(%),y為多糖保留率(%),z為蛋白質(zhì)去除率(%)。

      1.2.4 大孔樹(shù)脂的篩選 分別精密稱(chēng)取20.0 g樹(shù)脂于100 mL三角瓶中,加入粗多糖溶液40 mL,于40 ℃,120 r/min 搖床中吸附2.0 h,200目紗布過(guò)濾并用蒸餾水洗滌樹(shù)脂,合并濾液,定容至50 mL,分別測(cè)定吸附后的多糖保留率、脫色率和蛋白質(zhì)去除率,參照1.2.3對(duì)大孔樹(shù)脂脫色除蛋白效果進(jìn)行評(píng)分。

      1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 考察了樹(shù)脂用量(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL)、吸附溫度(30、40、50、60、70 ℃)、吸附時(shí)間(1.0、2.0、3.0、4.0 h)及pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)對(duì)樹(shù)脂脫色除蛋白效果的影響。

      1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件,設(shè)計(jì)Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗(yàn),利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果,確定樹(shù)脂最佳吸附條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)定見(jiàn)表1。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      樹(shù)脂篩選及單因素試驗(yàn)顯著性分析均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行。響應(yīng)面試驗(yàn)中方差分析采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

      龍眼多糖提取液中的色素與蛋白質(zhì)是其多糖分離純化過(guò)程中的主要雜質(zhì),色素與蛋白質(zhì)的含量過(guò)高,會(huì)降低多糖在下一步凝膠色譜分離純化的效果。由表2可知,樹(shù)脂D301-R、D001×7和D280的脫色效果明顯優(yōu)于其他4種樹(shù)脂(p<0.05)。在蛋白質(zhì)去除方面,D280(38.61%)和HPD-100A(36.73%)的去除率較低,D001×7、D3520、D296、NKA-9樹(shù)脂的蛋白去除率在60%左右,D301-R的蛋白質(zhì)去除率最高,為75.56%(p<0.05),且其多糖保留率也相對(duì)較高(86.74%)。

      綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選確定D301-R為龍眼粗多糖提取液脫色除蛋白的最優(yōu)樹(shù)脂,進(jìn)行后續(xù)單因素與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

      2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

      2.2.1 吸附時(shí)間對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖1可見(jiàn),吸附時(shí)間在1.0~4.0 h時(shí),隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng),脫色率和多糖保留率逐漸升高,但是多糖保留率逐步下降。當(dāng)時(shí)間大于2.0 h后,樹(shù)脂對(duì)色素和蛋白質(zhì)的去除效果不再顯著增加,但對(duì)多糖的吸附明顯增多。綜合上述因素,確定D301-R脫色除蛋白的吸附時(shí)間為2.0 h。

      2.2.2 pH值對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖2可見(jiàn),多糖溶液的pH值能影響樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)和色素的吸附,在pH3.0~7.0范圍內(nèi),隨著pH值的降低蛋白去除率和脫色率逐漸升高,但是較低pH值會(huì)導(dǎo)致多糖降解,導(dǎo)致多糖保留率降低。綜合上述因素,確定D301-R脫色除蛋白的pH值為5.0。

      2.2.3 樹(shù)脂用量對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖3可見(jiàn),在一定范圍內(nèi),蛋白去除率和脫色率隨樹(shù)脂用量的增加而提高。當(dāng)樹(shù)脂用量超過(guò)0.6 g/mL時(shí),蛋白質(zhì)和色素的去除率不再顯著提高,反而會(huì)增加多糖的吸附。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定樹(shù)脂的用量為0.6 g/mL。

      2.2.4 溫度對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖4可見(jiàn),吸附溫度在30~70 ℃時(shí),隨著吸附溫度的升高,多糖保留率和蛋白去除率升高,當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)其蛋白去除率不再顯著增加。脫色率隨溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí),樹(shù)脂對(duì)色素的吸附效果下降,綜合以上因素,確定D301-R脫色除蛋白溫度為50 ℃。

      2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

      2.3.1 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

      通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)溫度、pH值和樹(shù)脂用量3個(gè)因素分析得到以下實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果(見(jiàn)表3)。

      2.3.2 回歸模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)2.3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到x(脫色率)、y(多糖保留率)、z(蛋白去除率)為響應(yīng)值的回歸方程:

      x=75.56+1.19A-0.16B+0.31C-0.020AB+0.038AC-0.095BC-6.42A2-2.99B2-1.85C2

      y=93.51-2.13A-0.13B-0.49C-0.36AB-0.003AC+0.11BC-1.92A2-2.52B2-1.11C2

      z=91.55+0.78A-0.25B+0.41C-0.68AB-0.49AC-1.24BC-2.01A2-2.02B2-2.06C2

      上述回歸方程的方差分析如表4所示,由表中ANOVA分析結(jié)果可知,3個(gè)模型的p<0.001(極顯著),失擬項(xiàng)p>0.05(不顯著),表明方程擬合性好,實(shí)驗(yàn)誤差小。模型x,y,z的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998 3、0.993 3和0.995 4,表明模型的線(xiàn)性較好。x模型的AdjR2=0.996 1,表明該模型擬合度較好,0.35%的變異系數(shù)(CV)表明該模型重現(xiàn)性好。y和z模型中,變異系數(shù)分別為0.5%和1.1%,表明這2個(gè)模型擬合度和重現(xiàn)性好。

      綜合以上分析,表明3個(gè)模型擬合度和重現(xiàn)性較好,可以較好的反映D301-R樹(shù)脂吸附因素與多糖保留率和脫色除蛋白效果的關(guān)系。

      從各因素的顯著性水平可知,對(duì)脫色率的影響次序分別為:溫度>pH值>樹(shù)脂用量;對(duì)多糖保留率的影響次序?yàn)椋簻囟?樹(shù)脂用量>pH值,3個(gè)因素均顯著(p<0.05)影響蛋白保留率。3個(gè)因素的二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)脫色率、多糖保留率和蛋白去除率均有顯著影響(p<0.001)。溫度和pH值的交互項(xiàng)AB顯著影響多糖保留率(p<0.05)和蛋白去除率(p<0.001),對(duì)脫色率無(wú)顯著影響(p>0.05)。樹(shù)脂用量與溫度和pH值的交互項(xiàng)AC、BC對(duì)蛋白去除率的影響顯著(p<0.01),對(duì)脫色率和蛋白去除率無(wú)顯著影響(p>0.05)。

      2.3.3 交互作用響應(yīng)面分析

      (1)脫色率交互作用響應(yīng)面分析。由溫度和pH值對(duì)脫色率影響的分析(圖5)可以看出響應(yīng)面比較陡峭,等高線(xiàn)接近圓形,表明溫度和pH值對(duì)脫色率的影響顯著,它們的交互作用不顯著。圖6溫度和樹(shù)脂用量對(duì)脫色率的影響顯著,二者的交互作用顯著。當(dāng)溫度在48~52 ℃之間時(shí),脫色率隨著樹(shù)脂用量的變化顯著提高,能達(dá)到最大值。圖7可以看出pH值和樹(shù)脂用量對(duì)脫色率影響不顯著,二者交互作用不顯著。

      (2)多糖保留率交互作用響應(yīng)面分析。由圖8可以看出,溫度和pH值對(duì)多糖保留率有顯著影響,溫度在45 ℃左右時(shí),多糖保留率能夠達(dá)到最大值。由等高線(xiàn)可以看出,二者的交互作用不顯著,pH值在4.5~5.5,溫度在45 ℃左右時(shí)多糖保留率較高,能達(dá)到最大值。由圖9可以看出溫度和樹(shù)脂用量對(duì)多糖保留率影響不顯著,較低溫度可以減少樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附,達(dá)到較高的多糖保留率,二者交互作用不顯著。由圖10可以看出,溫度和樹(shù)脂用量對(duì)多糖保留率影響顯著,但二者的交互作用不顯著。

      (3)蛋白去除率交互作用響應(yīng)面分析。由圖11可以看出,溫度和pH值對(duì)蛋白去除率影響顯著,二者交互作用顯著,吸附溫度高于55 ℃或低于45 ℃都不利于蛋白質(zhì)的去除,pH值接近5.0時(shí)蛋白去除效果較好。由圖12可以看出,溫度和樹(shù)脂用量對(duì)蛋白去除率影響顯著,二者交互作用明顯。圖13表明,pH值和樹(shù)脂用量對(duì)蛋白去除率影響顯著,二者交互作用顯著,綜合分析,3個(gè)因素對(duì)蛋白去除率影響明顯,每?jī)蓚€(gè)因素交互作用顯著,由等高線(xiàn)可以看出,pH值和樹(shù)脂用量之間的交互作用更顯著。

      2.4 D301-R脫色除蛋白最佳工藝條件

      通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析,確定D301-R對(duì)龍眼多糖脫色除蛋白的最佳工藝條件為:溫度47.81 ℃、pH4.96、樹(shù)脂用量0.61 g/mL,此條件下脫色率為75.55%,多糖保留率為93.53%,蛋白去除率為91.55%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取溫度48 ℃,pH5.0,樹(shù)脂用量0.61 g/mL進(jìn)行。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)脫色率為(75.32±0.64)%,多糖保留率為(93.37±0.86)%,蛋白去除率為(91.83±0.79)%,表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理可靠。

      3 討論與結(jié)論

      脫色除蛋白是植物多糖純化的步驟之一,相對(duì)于傳統(tǒng)的Sevag法除蛋白、H2O2脫色等方法,大孔樹(shù)脂具有操作便捷、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)[16-19]。目前,主要采用離子交換和吸附樹(shù)脂對(duì)植物多糖進(jìn)行脫色除蛋白。離子交換樹(shù)脂主要通過(guò)離子鍵與帶電荷的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合,達(dá)到除雜目的。吸附樹(shù)脂主要通過(guò)分子內(nèi)的疏水基相互作用進(jìn)行吸附除去雜質(zhì)。針對(duì)不同來(lái)源的的多糖,不同類(lèi)型樹(shù)脂的除雜效果不同。

      本研究結(jié)果顯示,7種樹(shù)脂對(duì)龍眼粗多糖溶液具有不同的除雜效果,D301-R樹(shù)脂具有相對(duì)較好的除蛋白脫色素效果。而同為陰離子交換樹(shù)脂的D296除雜效果則較差,這一結(jié)果可能是由于兩者的功能基團(tuán)差異造成的。D301-R的功能基團(tuán)為-N(CH3)2屬于弱堿性,而D296的功能基團(tuán)為-N+(CH3)3屬于強(qiáng)堿性,在弱酸性條件下龍眼多糖主要為弱極性酸性多糖和中性多糖,所以D301-R具有更佳的脫色除蛋白效果和較低的多糖吸附量。研究顯示,樹(shù)脂孔徑大小是影響其除雜效果的重要因素之一,當(dāng)樹(shù)脂孔徑大小與溶液中色素大小適應(yīng)時(shí),更易于色素等被吸附達(dá)到除雜目的[20]。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,孔徑為85~90 μm的D3520和HPD-100A的除雜效果顯著優(yōu)于NKA-9樹(shù)脂(孔徑為155~165 μm),這可能是由于龍眼多糖溶液中的色素主要為小分子色素造成的。

      本研究結(jié)果顯示,D301-R樹(shù)脂對(duì)龍眼多糖具有較好脫色除蛋白效果,經(jīng)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,確定其最佳工藝條件為溫度48 ℃,pH5.0,樹(shù)脂用量0.61 g/mL,吸附時(shí)間2.0 h。在此工藝條件下,龍眼多糖的脫色率為75.32%,蛋白去除率為91.83%,多糖保留率為93.37%,其蛋白去除率、多糖保留率較文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]有顯著提高。同時(shí)研究顯示,在脫色除蛋白過(guò)程中,樹(shù)脂可能會(huì)吸附部分糖-蛋白、糖-色素等絡(luò)合物,造成多糖的損失。對(duì)龍眼多糖脫色除蛋白工藝還需進(jìn)一步研究。

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