郭曉強

基因編輯從傳統(tǒng)的基因打靶，到改進的嵌合核酸酶技術，再到最新的RNA或DNA指導的核酸酶技術，取得了快速發(fā)展，為生命科學研究和臨床應用提供了簡捷有效的操作工具。其應用潛力巨大，但仍須解決脫靶等相關技術問題。

DNA是遺傳信息載體，基因是一段具特定生物學功能的DNA片段，決定生物體生老病死等各種生命過程?；蚓庉嫞╣ene editing）指根據(jù)科研或臨床實際需要對目的基因（亦稱靶DNA）進行插入、移除或替換等精確遺傳操作，從而達到預定目的（引入或修復突變）之過程。鑒于基因在正常發(fā)育和疾病發(fā)生中的重要性，這項研究的意義不言而喻。而要完成基因編輯，工具必不可少，多種核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)為各種技術的發(fā)明提供了可靠保證。在此基礎上基因編輯技術經(jīng)歷了多階段的發(fā)展過程并顯示了多方面的應用前景。

限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)與應用

故事要從1950年代講起。1952年，意大利裔美國微生物學家盧里亞（S.E.Luria，1969年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者）發(fā)現(xiàn)了細菌限制一修飾現(xiàn)象。同一種噬菌體對不同菌株具有不同的感染力，如極易感染大腸桿菌C菌株的入噬菌體對K菌株感染力僅是對C菌株的千分之一，因此將大腸桿菌K菌株抵抗入噬菌體感染稱為“宿主控制的噬菌體限制”，但對這種現(xiàn)象的機制缺乏了解。

1962年，瑞士科學家阿爾伯（W.Arber）提出解釋細菌修飾一限制機制的假說。他推測細菌內存在兩類酶，一類為核酸內切酶，可特異識別噬菌體DNA并進行剪切，從而限制入侵；另一類為DNA甲基化酶，對自身DNA相應序列進行甲基化修飾，破壞核酸內切酶的自我識別，從而避免“誤傷”。

1968年，阿爾伯和美國梅塞爾森（M.S.Meselson）同時從大腸桿菌鑒定出核酸內切酶，該酶可識別特定DNA序列，但是在隨機位置上剪切DNA，不具特異性，稱為Ⅰ型限制性內切酶。

1970年，美國微生物遺傳學家史密斯（H.O.Smith）和同事又從嗜血流感細菌（Haemophilusinfluenzae）中分離得到一種核酸內切酶，該酶可特異識別噬菌體雙鏈DNA并發(fā)揮剪切作用，但對細菌DNA無效，符合阿爾伯當初的預測。史密斯和同事還鑒定出該酶的識別及剪切序列。該酶被命名為HindⅡ，這是人類發(fā)現(xiàn)的第一個Ⅱ型限制性內切酶。HindⅡ的發(fā)現(xiàn)引起科學界極大關注，從而掀起了一場尋找Ⅱ型限制性內切酶的熱潮。另一方面，限制性內切酶的巨大應用潛力不久就被史密斯同事內森斯（D.Nathans）發(fā)現(xiàn)和首先開發(fā)。

1970年，內森斯利用史密斯贈予的限制性內切酶HindⅡ對猿猴病毒40（SV40）環(huán)形DNA進行酶切，獲得大小不同的11個DNA片段（意味著SV40基因組含有10個HindⅡ的識別與剪切位點），首次獲得了SF40基因組的限制性內切酶圖譜。

1978年，阿爾伯、史密斯和內森斯因“限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)及分子遺傳學應用”而分享諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)及應用為DNA研究提供了重要工具，它們被稱為“DNA操作的手術刀”。

DNA重組和基因工程

在內森斯切開SV40 DNA基礎上，美國斯坦福大學生物化學家伯格（P.Berg）又往前邁進了一大步。

1972年，伯格在體外用限制性內切酶將SV40DNA和噬菌體DNA分別切開，嗣后又借助DNA連接酶將它們重新連接為整體，從而首次在體外實現(xiàn)了兩個不同來源DNA的人工重組，伯格因這項成就分享1980年諾貝爾化學獎。不久，科恩（S.N.Cohen）和博耶（H.Boyer）進一步把重組DNA轉入大腸桿菌，開啟了基因工程大門。重組DNA和基因工程的成功，推動了生物技術領域的快速發(fā)展，更重要的是給科研人員提供了無限想象空間，即人類可以用技術手段對DNA進行主動操作，這奠定了今天基因編輯的思想基礎。

同源重組與基因打靶

最早的基因編輯利用機體自身的同源重組（homologous recombination）。同源重組是指兩段相似或相同序列的DNA發(fā)生交換的現(xiàn)象，主要用于DNA雙鏈斷裂后修復，此外還是減數(shù)分裂期新序列產生的基礎。早在1947年，美國微生物學家萊德伯格（J.Lederberg。1958年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者）就在細菌中發(fā)現(xiàn)了遺傳重組現(xiàn)象，1970年代在哺乳動物中也鑒定成功，但對于機體內部的同源重組是否可應用于人工遺傳操作，人們不得而知。

1980年代初，意大利裔美國遺傳學家卡佩基（M.R.Capecchi）堅信同源重組可應用于細胞內DNA的操作。他首先獲得一種攜帶新霉素抗藥基因缺陷的細胞系（添加新霉素可造成細胞死亡），然后通過顯微注射方式將正常新霉素抗藥基因導入細胞，結果細胞恢復了抗性。實驗也證實，通過同源重組方式可完成基因替換。與此同時，另一位美國科學家史密西斯（O.Smithies）完成了珠蛋白的同源重組實驗。1987年，多家實驗室在小鼠胚胎干細胞上利用同源重組實現(xiàn)基因替換和引入突變，并最終制備成功疾病模型。這種技術一般稱為基因打靶（gene targeting）。隨后經(jīng)過完善與改進，該技術在生命科學多個領域中得到廣泛應用，卡佩基、史密斯以及另外一位科學家也因此分享2007年度的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

雖然基因打靶技術取得巨大成功，但是該技術存在一個明顯缺陷，就是在正常情況下，哺乳動物細胞和模式動物體內的同源重組發(fā)生率極低，因此基因打靶技術成功率不高。后來發(fā)現(xiàn)，DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）可使同源重組效率大大提高，于是研究人員開始尋找增加細胞內DSB發(fā)生的策略，他們的眼光重又回到限制性內切酶。

大范圍核酸酶

然而，傳統(tǒng)的限制性內切酶也存在一個巨大不足，其大部分識別位點在4～6個堿基對（base pair，bp）。這對體外短片段DNA的操作問題不大，但對基因組層面的操作則問題多多。以剪切6bp的內切酶為例，理論上平均4096（4⁶）個堿基就存在一個剪切位點。如果將這類酶應用于人基因組（30億堿基對）的編輯，理論上一次可產生7.3×10⁵個以上斷裂點；若要保證切割位點唯一性，則須識別16個堿基（4¹⁶≈43億）以上（隨后發(fā)展的多種基因編輯技術的常見識別位點在20個上下），傳統(tǒng)限制性內切酶顯然無法應用。幸運的是，自然界還存在一類特殊的核酸內切酶。

大范圍核酸酶（meganuclease）亦稱歸巢核酸內切酶（homing endonuclease），存在于原核生物和真核生物的線粒體/葉綠體等當中，大部分由內含子編碼。大范圍核酸酶可特異識別DNA長片段，一般在12～40bp之間，在數(shù)量上能滿足需求。1985年，一種大范圍核酸酶I-SceI被發(fā)現(xiàn)，它可特異性識別18 bp的DNA片段，在此基礎上將DNA切開而產生雙鏈斷裂。1990年代，I-SceI被用于輔助基因編輯，可使傳統(tǒng)基因打靶效率大大提高。

但大范圍核酸酶在基因編輯的應用方面有重大瓶頸。首先，天然大范圍核酸酶種類有限，對于人類大部分基因找不到相應的酶識別；而新找一個識別給定序列的大范圍核酸酶，其機會實在太渺茫。其次，改進的余地也有限。大范圍核酸酶的識別與剪切兩種功能利用同一結構域，改造識別結構域就會影響剪切活性，因此最終找到理想的酶是一項幾乎無法完成的任務?？茖W家必須尋找新的策略。

鋅指核酸酶（ZFN）

1981年從海床黃桿菌（Flavobacteriumokeanokoites）中分離得到一種傳統(tǒng)的IIS型限制性內切酶，被命名為FokI。相對于其他限制性內切酶，F(xiàn)okI擁有自己獨特的結構，含兩個相對獨立的結構域，一個是N端的DNA結合結構域（可特異識別5-GGATG-3），另一個為c端的DNA剪切結構域。此特征為工程化改造提供了良機。因識別序列太短（僅5bp），天然FokI酶自然也無法應用于基因編輯，但相對獨立的剪切結構域倒是可以作為DNA“剪刀”，跟具有識別功能的其他結構域聯(lián)合使用。

轉錄因子是一類特異識別DNA序列并促進基因轉錄的蛋白質。轉錄因子識別DNA主要通過三類結構域來完成，其中一類為依賴鋅離子的鋅指結構域（zinc finger），典型特征是大約30個氨基酸可識別3個核苷酸，最終使64種可能的核苷酸三聯(lián)體都有相應的鋅指結構域加以識別。研究人員可根據(jù)需要將這些鋅指結構域進一步聯(lián)合，制造出一系列識別3的倍數(shù)核苷酸的組合體，如識別18個核苷酸理論上需6個鋅指結構域串聯(lián)即可，這種特征使它們成為DNA特異識別之重要工具。

1996年，美國約翰·霍普金斯大學錢德拉西格蘭（S.Chandrasegaran）首次將三個串聯(lián)的鋅指結構域（識別9個核苷酸）與FokI的C端內切酶結構域通過一段連接蛋白融合，制造出第一個嵌合型核酸內切酶——鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN），并在體外證明該酶對靶DNA具特異剪切能力。此外，ZFN發(fā)揮活性時往往采用同源二聚體方式，特別是FokI核酸內切酶結構域必須在兩端DNA均完成識別的前提下方可執(zhí)行剪切作用，從而最大限度地避免了脫靶效應的發(fā)生。

隨后研究人員探索這種嵌合核酸酶是否也可在細胞內對靶DNA起識別與剪切作用。2001年，首次在果蠅體內嘗試成功，與傳統(tǒng)基因打靶技術聯(lián)用可顯著增加基因編輯效率，迅速成為基因編輯領域的新熱點。

ZFN技術相對于大范圍核酸酶而言是巨大進步，但依然存在許多不足，其中針對DNA特異性序列的鋅指結構域的組合與設計是極大挑戰(zhàn)，導致技術進展緩慢，雖取得一定成功，但很難在大部分實驗室里普及。

轉錄激活樣效應蛋白核酸酶（TALEN）

許多革蘭氏陰性菌在感染宿主過程中，可將自身蛋白質注入細胞，通過影響特定基因的表達而增強自身的生存適應性。2007年德國哈勒一維騰貝格大學（University of Halle-Wittenberg）的博納斯（U.Bonas）發(fā)現(xiàn)植物病原菌黃單胞菌屬（Xanthomonasgenus）可制造一種“毒力”蛋白質，該蛋白質由于具有激活宿主基因表達的功能，被命名為轉錄激活樣效應蛋白（transcription activator-like effector，TALE）。2009年，博納斯以及美國艾奧瓦州立大學的波格丹諾夫（A.Bogdanove）同時闡明了TALE激活基因表達的作用機制。TALE的結構由三部分組成，分別為核定位序列、DNA識別結構域和靶基因轉錄激活結構域。TALE的DNA識別結構域由多個單體串聯(lián)重復構成，每個單體均含34個氨基酸，除12和13位氨基酸外其他序列完全相同，而正是這兩個氨基酸的差異決定了核苷酸識別的特異性。每一個TALE識別單體對應于一種核苷酸，因此DNA四種堿基只需四種單體即可（遠少于ZFN的64種結構域），從而使得構建多核苷酸識別的設計大大簡化了。

隨后，研究人員將根據(jù)靶DNA序列設計的TALE單體串聯(lián)后，也通過連接蛋白與FokI的c端內切酶結構域相連，構建出TALE核酸酶（TALE nuclease.TALEN）。體內外實驗表明，它可以實現(xiàn)對靶DNA的特異性剪切，迅速應用于基因編輯領域，并先后構建成多種模型動物，成為一顆耀眼新星，被《自然方法學》雜志評為“2011年度方法”。

TALEN相對于ZFN的高效、簡潔，獲得許多科研人員青睞。盡管在TALE單體的串聯(lián)設計方面仍存在諸多不確定性，但他們相信，問題可以通過進一步完善技術得到解決。就在大家對TALEN技術的前景充滿期許時，另一高效基因編輯技術橫空出世，瞬間改變了該領域發(fā)展走向。

RNA介導的DNA編輯（CRISPR-Cas9）

1987年一個日本團隊在細菌DNA中首次意外發(fā)現(xiàn)一種特殊結構，其中“重復序列一居間序列（spacer）-重復序列”交替出現(xiàn)。隨后發(fā)現(xiàn)此特殊結構在原核生物中普遍存在。2002年研究人員將其統(tǒng)稱為成簇規(guī)律性間隔短回文重復（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat，CRISPR）；并將序列附近的編碼基因命名為CRISPR相關因子（CRISPR-associated，Cas），推測它們參與CRISPR生物學功能。

2005年，研究發(fā)現(xiàn)CRISPR居間序列來自噬菌體或質粒等細菌染色體以外的DNA，這一發(fā)現(xiàn)暗示了它們重要的生理功能。在借鑒真核生物RNA干擾的基礎上，提出了解釋CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機制的獲得性免疫假說：CRISPR序列可轉錄出包含居間序列的RNA，該RNA與外源DNA轉錄出的RNA互補形成雙鏈結構，隨后Cas蛋白對外源RNA進行剪切，從而達到抵御病毒入侵的目的。

2007年，法國丹尼斯克（Danisco）集團微生物學家巴朗古（R.Barrangou）等以嗜熱鏈球菌為材料證明CRISPR-Cas確是一種細菌獲得性免疫系統(tǒng)。這一突破立刻引起許多科學家高度重視，因此想進一步探索其作用機制。2008年，兩個研究小組發(fā)現(xiàn)CRISPR.Cas系統(tǒng)在發(fā)揮免疫機制的作用時確實可轉錄出RNA，即crRNA（CRISPR-related RNA）。crRNA有引導作用，然而它們更多識別的是DNA，而非當初假說認為的RNA。Cas蛋白有核酸內切酶活性，多種Cas蛋白聯(lián)合可特異性地剪切與crRNA互補的DNA而形成雙鏈斷裂。該發(fā)現(xiàn)重要性顯而易見，crRNA負責識別，Cas蛋白負責DNA剪切，兩者具有用于基因編輯的兩項基本能力。不過已發(fā)現(xiàn)的兩類CRISPR-Cas系統(tǒng)（Ⅰ型和Ⅲ型）均較復雜，特別是進行DNA剪切時需多個Cas9蛋白共同作用，而ZFN和TALEN都只需一種嵌合核酸酶即可，因此應用優(yōu)勢并不明顯。

2011年，瑞典于默奧大學（Umefi University）微生物研究中心法國微生物學家沙爾龐捷（E.M.Charpentier）和同事在研究Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)，crRNA參與DNA識別還需反式激活的CRISPR來源的RNA（trans-activating CRISPR-derived RNA，tracrRNA）協(xié)助。這雖會增加RNA的需求數(shù)量（而RNA操作相對容易），但執(zhí)行DNA剪切時只需一種Cas9蛋白即可。此新型CRISPR-Cas系統(tǒng)還吸引了美國加州大學伯克利分校結構生物學家杜德娜（J.A.Doudna），她與沙爾龐捷共商改造Ⅱ型系統(tǒng)。

2012年，杜德娜和沙爾龐捷聯(lián)合小組將crRNA和tracrRNA兩種RNA二合一，形成單鏈引導RNA（single guide RNA，sgRNA），其中crRNA部分負責與靶DNA配對識別，而tracrRNA負責維持空間結構，在RNA指導的核酸酶（RNA-guided nuclease，RGN）Cas9催化下，完成對靶DNA雙鏈的特異剪切。2013年，哈佛大學的張鋒和丘齊（G.M.Church）研究小組采用這套系統(tǒng)，在細胞內完成靶基因編輯。

CRISPR-Cas9相對于傳統(tǒng)的嵌合核酸酶技術，優(yōu)點顯而易見。首先是設計簡單，擯棄了嵌合酶技術的蛋白質結構域DNA識別設計理念，隨之用符合沃森一克里克配對的理念進行sgRNA設計。其次在操作方面，傳統(tǒng)嵌合酶設計在識別結構域后還要與核酸內切酶剪切結構域連接，如果有多個靶DNA的編輯，就需要多次的融合。CRISPR-Cas9在Cas9保持不變前提下只需要對sgRNA進行操作，因此在同時進行多基因編輯方面更顯高效。CRISPR-Cas9由于具有高效簡便的特點，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便引發(fā)了一場基因編輯研究的熱潮，這項技術迅速風靡全世界。

DNA介導的DNA編輯（ssDNA-Ag0）

1998年，美國法爾（A.Z.Fire）和梅洛（C.C.Mello）在合作研究線蟲肌肉相關蛋白質的生物學功能過程中，發(fā)現(xiàn)同時注入針對該基因的正義RNA和反義RNA能起干擾基因表達的作用，此現(xiàn)象被稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。2006年，法爾與梅洛為此分享諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，激發(fā)了隨后對其作用機制的研究。原來，雙鏈RNA首先被加工為21～23個核苷酸的雙鏈RNA，然后其中一條鏈與靶mRNA及相關因子形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencing complex，RISC），完成對mRNA的剪切，而Argonaute（Ago）蛋白是RISC的一種關鍵成分。

Ago蛋白最初在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)，由于基因突變體形態(tài)非常類似于軟體動物船蛸（Argonautaargo）而得名。隨后從果蠅、小鼠和人等發(fā)現(xiàn)Ago普遍存在。Ago蛋白擁有一個C端Piwi結構域，具RNA核酸內切酶活性，從而對靶mRNA實現(xiàn)剪切。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不僅真核生物而且包括細菌和古菌在內的原核生物亦普遍存在Ago蛋白。借鑒CRISPR.Cas9研究經(jīng)驗，研究人員提出，原核生物Ago蛋白也參與細菌免疫機制，意味著也能用于基因編輯。

2014年，荷蘭瓦赫寧根大學（WageningenUniversity and Research Centre）范德奧斯特（J.van der Oost）發(fā)現(xiàn)古菌——噬熱棲熱菌（Thermusthermophilus）的Ago蛋白（TtAgo）還具有DNA核酸內切酶活性，但和Cas9不同，TtAgo剪切靶DNA時依賴單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）而不是RNA，說明Ago蛋白是一種DNA指導的核酸酶（DNA-guided nuclease，DGN）。此發(fā)現(xiàn)在闡明一種新型原核生物的免疫系統(tǒng)作用機制同時，還顯示ssDNA-Ago系統(tǒng)也可應用于基因編輯。然而，該技術的應用前景尚待進一步確定。鑒于三大類生物分子DNA、RNA和蛋白質的生物學作用特征，即DNA是遺傳信息攜帶者，蛋白質是生物學功能具體執(zhí)行者，而RNA更多發(fā)揮中介和調節(jié)等多重生物學作用（近幾年生命科學進展更多出現(xiàn)在RNA領域，包括核酶、RNA干擾等），功能多樣的RNA作為引導分子，可能比DNA在基因編輯方面具有優(yōu)勢。當然，此推測需要充分的實驗加以證實。

基因編輯的應用

基因編輯工具更多地引入DNA雙鏈斷裂（DSB），由于機體對DNA完整性的要求，因此隨后會啟動修復機制。DNA修復系統(tǒng)主要有兩種類型，分別為非同源末端連接（non-homologous end ioininz.NHEJ）和同源指導的修復（homology-directedrepair，HDR）。NHEJ無需同源序列，可將斷裂的雙鏈重新連接，然而在連接過程中會出現(xiàn)堿基丟失或增加，最終造成基因的缺失或插入突變。HDR是在同源DNA存在前提下，以同源DNA信息為模板完成DNA斷裂處修復。如果按基因打靶策略在引入雙鏈斷裂的同時補充打靶序列，可實現(xiàn)精確替換，既可引入定點突變，又可實現(xiàn)突變基因的修復?；蚓庉嬐ㄟ^對目標DNA的精確操作，達到控制生物性狀和行為的目的，因此擁有廣泛的應用前景。

首先，可作為便捷的實驗工具。實驗室基因功能研究的快捷方法是RNA干擾技術，但RNA干擾只影響mRNA含量，并未去除基因本身，而傳統(tǒng)基因敲除由于費事費錢，其應用受到限制。當前的基因編輯技術可快速制備突變體，加快了實驗研究進程。

其次，用于模式生物制備。用傳統(tǒng)基因打靶技術制備的模式動物，一方面效率低，另一方面還受限于干細胞；而用最新基因編輯技術已完成大量物種的基因敲除，制備出各種特定疾病的動物模型，并且時間大大縮短。采用CRISPR-Cas9等技術不僅能對傳統(tǒng)模式動物如小鼠、大鼠等進行基因編輯，還能在大型哺乳動物如豬和牛以及猴等靈長動物中開展基因編輯。

第三，用于物種改良。新的基因編輯技術對動植物改良有重要意義，如借助CRISPR-Cas9完成對豬體內病毒的去除工作等多方面的應用。

第四，具有潛在的臨床價值。最新的基因編輯技術已在遺傳病、血液病和感染病等領域顯示了巨大臨床價值，還為其他疾病的診治提供了重要借鑒。當然尚需進一步的探索以保證應用的安全性。

第五，用于其他領域。通過對現(xiàn)有技術的改造，可望在基因表達調控等領域也發(fā)揮重要作用。

基因編輯的前景

基因編輯從原理上講只有一種類型，就是借助核酸酶實現(xiàn)DSB，但根據(jù)DNA序列特異識別機制的差異，可分為兩大類，即嵌合酶技術（如ZFN和TALEN等）和核酸指導的核酸酶技術（CRISPR-Cas9和ssDNA-Ago等）?；蚓庉嫷难葑儦v史也基本沿著細菌-免疫系統(tǒng)-核酸酶這一線索展開。

由基因編輯發(fā)展歷程可見科學發(fā)展一般規(guī)律。第一代基因編輯為單組分（天然核酸內切酶或人工嵌合核酸酶），第二代基因編輯為雙組分（引導核酸加核酸內切酶），突破性進展在于用精確堿基配對取代蛋白質一DNA識別。但兩代技術均存在一個重大缺陷，就是需要原核核酸內切酶，意味著應用于臨床存在誘發(fā)機體免疫應答的潛在危險。因此推測，是否有誕生第三代基因編輯的可能？即重回單組分，但此時已不是蛋白質而是RNA。RNA本身既具有識別作用，有時又具有核酸內切酶活性（核酶），這樣既減少了多組分困擾，又避免了外源蛋白質（對已有基因編輯技術必不可少）的不利影響。當然，這想法能否實現(xiàn)還要深入研究。

基因編輯研究分四個層面，即體外實驗、細胞水平、動物水平和臨床應用。目前研究人員已在前三個層面取得重大突破，對其臨床應用也充滿期待。然而。真要把基因編輯應用于臨床，目前仍有許多問題要解決，如怎樣提升體內基因編輯過程中的轉染和編輯效率，怎樣避免潛在的脫靶效應及不確定因素影響，此外還涉及倫理問題，須進一步完善相關技術，盡可能避免不良效應。上面提到DSB的引入，這也意味著正常情況下細胞內DSB發(fā)生率極低，暗示引入過多DSB對細胞可能是頗大威脅，為基因編輯安全性埋下了隱患。

總之，基因編輯技術猶如雙刃劍，我們在看到其快速發(fā)展和廣闊應用前景同時，也要理性估計其應用的得失，尤其對未來可能的臨床應用更宜采取慎重態(tài)度。

關鍵詞：基因編輯 基因打靶 鋅指核酸酶 TALEN CRISPR-Cas9 ssDNA-Ago