崔彥芹 李尚偉 張麗萍 羅洪發(fā) 李云峰 查仁明

摘要：【目的】構(gòu)建雙價抗蟲基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，為選育廣譜、高抗轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻提供技術(shù)參考。【方法】構(gòu)建半夏凝集素基因（pta）和蘇云金桿芽孢菌基因（Bt）兩個抗蟲基因的雙價表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta，利用大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系輻恢838，同時對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS染色及PCR鑒定?！窘Y(jié)果】以構(gòu)建的雙價植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta為模板，PCR擴增到pta基因的部分片段，大小為807 bp，且該載體經(jīng)Hind Ⅲ酶切后，能得到15854 bp的中間載體pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段。對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS染色，得到3株轉(zhuǎn)基因陽性植株，經(jīng)PCR鑒定結(jié)果顯示外源基因已成功導(dǎo)入水稻?！窘Y(jié)論】通過構(gòu)建雙價抗蟲基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，成功獲得的轉(zhuǎn)基因植株可用于水稻抗蟲轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系及組合的研究，以提高其抗病蟲害能力。

關(guān)鍵詞： Bt基因；pta基因；載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因水稻；鑒定

中圖分類號： S511.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0169-05

0 引言

【研究意義】水稻是最重要的糧食作物之一，世界上半數(shù)以上的人口以水稻為主食。蟲害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因，據(jù)報道，田間水稻害蟲種類在624種以上，每年因螟蟲造成的產(chǎn)量損失達(dá)1.0×1010 t，對其品質(zhì)也造成嚴(yán)重威脅（劉立軍等，2009；朱禎，2010；張嵐等，2011），因此選育抗蟲水稻品種尤為重要，但僅靠常規(guī)育種難以解決抗蟲育種資源稀缺的問題，須通過研究轉(zhuǎn)基因水稻來完成。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）基因的表達(dá)產(chǎn)物為Bt毒蛋白，是一種殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP），其殺蟲效果安全、高效，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲具有高度特異性（孟志剛，2012）。半夏凝集素（Pinellia ternate agglutinin，pta）對同翅目害蟲如稻飛虱、葉蟬等有顯著抗蟲作用，故pta基因常作為外源基因應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物研究（趙歡和彭正松，2014）。在抗蟲育種時，若能將兩個基因同時導(dǎo)入作物中，便可避免抗性基因的單一性和脆弱性，維持作物抗蟲的持久性?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，隨著植物基因工程的快速發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)胫参?，使其自身攜帶抗蟲能力以達(dá)到抗蟲目的（韓蘭芝等，2006）。熊恒碩等（2008）將含有CryIA（a）/CryIA（c）、pta和Bar基因的雙價植物表達(dá)載體p3300-Bt-pta轉(zhuǎn)化苜蓿子葉，成功獲得陽性轉(zhuǎn)化植株。田強強等（2011）構(gòu)建的雙價抗病蟲基因植物表達(dá)載體Lc-ChiA-pBI121可用于植物轉(zhuǎn)基因研究，提高植物抗病蟲害能力。Xiao等（2012）將pta和Cry1Ac基因同時導(dǎo)入大青，發(fā)現(xiàn)其協(xié)同作用可使植株對飛蛾和蚜蟲的抗性增強。張學(xué)明等（2015）用植物表達(dá)載體pC1301-LoxRi和pCAMBIA3301-KTi-SBA，構(gòu)建雙價表達(dá)載體pCAMBIA3301-SBA-Lox并轉(zhuǎn)化大豆，獲得轉(zhuǎn)基因大豆?！颈狙芯壳腥朦c】鱗翅目和同翅目是危害水稻較嚴(yán)重的昆蟲種類，Bt和pta基因分別對這兩類昆蟲有顯著抗蟲作用，但目前尚無將Bt和pta基因同時導(dǎo)入水稻而獲得廣譜性抗蟲水稻的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建雙價植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta，轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系輻恢838，以期獲得廣譜性抗蟲水稻，為獲得高抗、廣譜抗蟲水稻材料提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

受體材料為水稻優(yōu)良恢復(fù)系輻恢838，由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌LBA4404由西南大學(xué)水稻研究所提供。雙酶切載體pCAMBIA1301和質(zhì)粒pUC57-Bt和pCU57-pta由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。BamH I、Spe I等限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、GUS染液、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒及其他重要試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：瓊脂糖電泳儀（美國BIO-RAD公司）、UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）、微量移液器（德國Eppendorf公司）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 表達(dá)載體構(gòu)建 用BamH I和Spe I雙酶切載體pCAMBIA1301和質(zhì)粒pUC57-Bt，再用T4 DNA連接酶將兩者連接可獲得中間載體pCAMBIA1301-Bt，最后用Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒pCU57-pta和中間載體，并連接構(gòu)建雙價植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta。

1. 2. 2 載體轉(zhuǎn)化及鑒定 用熱激法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)抗生素篩選、PCR鑒定（引物見表1，反應(yīng)體系見表2，擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆茫?、Hind Ⅲ酶切鑒定和測序，獲得陽性克隆子。再用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，用凍融法將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，對農(nóng)桿菌進(jìn)行PCR和酶切鑒定，操作方法與大腸桿菌同（Sambrook and David，2002）。

1. 2. 3 含Bt-pta基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻 將含Bt-pta的根癌農(nóng)桿菌LBA4404送至武漢泊遠(yuǎn)生物科技有限公司，經(jīng)水稻成熟胚預(yù)處理、農(nóng)桿菌侵染、篩選Ⅰ、篩選Ⅱ、分化、生根及分子檢測等，以獲得Bt-pta雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻。

1. 2. 4 GUS組織化學(xué)染色 將轉(zhuǎn)基因水稻植株的嫩葉剪切后放于0.2 mL PCR管中，加入適量GUS染液，37 ℃下染色3～20 h，至藍(lán)色清晰可見。

1. 2. 5 PCR檢測 根據(jù)pta、GUS及Bt基因序列設(shè)計引物（表1）。PCR反應(yīng)體系（25.00 μL）：DNA模板 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 0.50 μL，引物F1和R1各1.50 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，加滅菌水至25.00 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 30 s，59～60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta如圖1所示。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，經(jīng)含抗生素培養(yǎng)基篩選，挑取大腸桿菌菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖2，擴增產(chǎn)物大小約807 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，可初步鑒定為陽性克隆。提取陽性大腸桿菌質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ酶切后（圖3），得到15854 bp的中間載體pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段（已插入酶切位點），表明目的基因pta已連接至中間載體pCAMBIA1301-Bt上，成功構(gòu)建雙價植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta。

2. 2 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定結(jié)果

轉(zhuǎn)化再生水稻植株經(jīng)馴化、移栽后，共獲得15株轉(zhuǎn)化植株，取其幼嫩葉片剪碎后進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖4所示，其中3株為轉(zhuǎn)基因陽性植株。對3株陽性植株的pta、Bt及GUS基因分別進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖5和圖6所示。Bt基因檢測結(jié)果表明，除陰性對照未擴增出目的片段外，陽性對照（陽性質(zhì)粒）及GUS染色呈陽性的3株轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果（396 bp）相符；pta基因檢測結(jié)果表明，陽性對照（陽性質(zhì)粒）及GUS染色呈陽性的3株轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果（314 bp）相符；GUS基因檢測結(jié)果表明，除陰性對照未擴增出目的片段外，陽性對照（陽性質(zhì)粒）及GUS染色呈陽性的3株轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果（350 bp）相符。

3 討論

目前單價轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸成熟，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作育種的研究領(lǐng)域。Datta等（1998）將Cry1Ab基因?qū)敫鞣N秈稻和粳稻中，獲得一系列對三化螟幼蟲具有高致死率的轉(zhuǎn)Bt基因水稻；張紅宇等（2003）首次成功將從半夏花序中克隆的半夏凝集素基因?qū)?個水稻品種，為pta基因在水稻抗蟲上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；戴軍等（2014）將Bt cry1Ah基因?qū)胗衩鬃越幌稻C31中，獲得1株對玉米螟有顯著抗性的轉(zhuǎn)基因植株。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲育種研究的深入，存在的問題日益凸顯，如轉(zhuǎn)單價抗蟲基因植株抗蟲譜單一，害蟲易產(chǎn)生抗性等。因此，近年國內(nèi)外的轉(zhuǎn)基因研究呈現(xiàn)由單一基因向多基因發(fā)展的趨勢（余桂容等，2015）。隨著技術(shù)的不斷成熟，可成功構(gòu)建雙價表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化小麥、煙草等作物中，培育出多種雙價轉(zhuǎn)基因植株，如范媛媛等（2004）構(gòu)建了植物表達(dá)載體p3300-Bt-pta并轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草；Yu和Wei（2008）將Bt和pta基因轉(zhuǎn)化小麥，并獲得雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因小麥。

本研究通過構(gòu)建雙價抗蟲基因表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta并轉(zhuǎn)化水稻，由于該植物表達(dá)載體是以GUS基因為報告基因，可通過檢測報告基因的表達(dá)產(chǎn)物來快速篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。但在將轉(zhuǎn)基因水稻從人工氣候箱移栽到海南三亞大田過程中，由于環(huán)境變化和長時間運輸導(dǎo)致大量禾苗死亡，只得到3株陽性轉(zhuǎn)基因植株，由于其數(shù)量較少，為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，未對其進(jìn)行農(nóng)藝形狀分析。此外，本研究僅對T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步的篩選和鑒定，根據(jù)孟德爾遺傳定律，基因在后代會產(chǎn)生分離，為得到純合和穩(wěn)定遺傳的植株，需進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因植株的后代進(jìn)行分子檢測如Southern blotting、Western blotting等及連續(xù)多代自交篩選和鑒定，將出現(xiàn)性狀分離的植株淘汰，篩選出高代純合轉(zhuǎn)基因植株，并對轉(zhuǎn)基因后代純系進(jìn)行株高、產(chǎn)量及相關(guān)性狀考察及抗蟲性鑒定。

4 結(jié)論

本研究篩選出3株Bt-pta雙價轉(zhuǎn)基因水稻，可用于水稻抗蟲轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系及組合的研究，以提高其抗病蟲害能力。

參考文獻(xiàn)：

戴軍，李秀影，朱莉，汪海，張杰，何康來，郎志宏，黃大昉. 2014. 轉(zhuǎn)Bt cry1Ah基因抗蟲玉米的分子檢測及農(nóng)藝性狀分析[J]. 生物技術(shù)通報，（5）： 62-67.

Dai J， Li X Y， Zhu L， Wang H， Zhang J， He K L， Lang Z H， Huang D F. 2014. Molecular detection and agronomic traits analysis of insect-resistant transgenic maize harboring Bt cry1Ah gene[J]. Biotechnology Bulletin，（5）： 62-67.

范媛媛，龐永珍，吳為勝，姚劍虹，唐克軒，武天龍. 2004. 雙價抗蟲植物表達(dá)載體p3300-bt-pta的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的初步檢測[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報， 22（1）： 1-6.

Fan Y Y， Pang Y Z， Wu W S， Yao J H， Tang K X， Wu T L.2004. Construction of plant expression vectors p3300-bt-pta containing binary insect resistance genes and their expression in transgenic tobaccos[J]. Journal of Shanghai Jiaotong University， 22（1）： 1-6.

韓蘭芝， 吳孔明， 彭于發(fā)， 郭予元. 2006. 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻生態(tài)安全性研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，12（3）： 431-436.

Han L Z， Wu K M， Peng Y F， Guo Y Y. 2006. Research advances in ecological safety of insect-resistant transgenic rice[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 12（3）： 431-436.

劉立軍， 王麗冰， 張巍， 顏亨梅. 2009. 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的安全性及其防范策略[J]. 生物技術(shù)通報， （S1）： 36-39.

Liu L J， Wang L B， Zhang W， Yan H M. 2009. Security of insect-resistant transgenic rice and the strategies to this rices potential effects[J]. Biotechnology Bulletin， （S1）： 36-39.

孟志剛. 2012. Bt殺蟲基因的結(jié)構(gòu)改造與功能研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.

Meng Z G. 2012. Structure optimization and function study of Bt gene[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences.

田強強， 徐利， 譚黎霞， 王敦， 李厚華. 2011. 雙價抗病蟲基因植物表達(dá)載體Lc-ChiA-pBI121的構(gòu)建[J]. 北方園藝，（11）： 101-103.

Tian Q Q， Xu L， Tan L X， Wang D， Li H H. 2011. Construction of Lc-ChiA-pBI121 plant expression vector containing two pest and disease resistant genes[J]. Northern Horticulture，（11）： 101-103.

熊恒碩， 康俊梅， 楊青川， 孫彥， 唐克軒. 2008. 雙價抗蟲植物表達(dá)載體p3300-bt-pta轉(zhuǎn)化苜蓿的初步研究[J]. 中國草地學(xué)報， 30（1）：21-26.

Xiong H S， Kang J M， Yang Q C， Sun Y， Tang K X. 2008. A primary study on transferring plant expression vectors containing binary insect resistance genes Bt CryIA（a）-pta or Bt CryIA（c）-pta into Alfalfa[J]. Chinese Journal of Grassland， 30（1）：21-26.

余桂容， 曹穎， 杜文平， 宋軍， 陳謙， 徐利遠(yuǎn). 2015. 抗蟲耐草甘膦雙價基因表達(dá)載體的構(gòu)建及玉米轉(zhuǎn)化[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 28（2）： 475-479.

Yu G R， Cao Y， Du W P， Song J， Chen Q， Xu L Y. 2015. Construction of binary vector obtaining insect & herbicide resistance genes and transformation of maize[J]. Southern China Journal of Agricultural Sciences， 28（2）： 475-479.

張紅宇， 吳先軍， 唐克軒， 汪旭東， 孫小芬， 周開達(dá). 2003. 半夏凝集素基因（pta）導(dǎo)入水稻及其表達(dá)的初步研究[J]. 遺傳學(xué)報， 30（11）： 1013-1019.

Zhang H Y， Wu X J， Tang K X， Wang X D， Sun X F， Zhou K D. 2003. A primary study of transferring the Pinellia tenata agglutinin（pta） gene into rice and expression[J]. Acta Genetica Sinica， 30（11）： 1013-1019.

張嵐， 林克劍， 李飛， 侯茂林. 2011. 轉(zhuǎn)cry1C和cry2A不同抗蟲基因水稻品種對非靶標(biāo)害蟲灰飛虱生物學(xué)特性的影響[J]. 植物保護， 37（6）： 120-125.

Zhang L， Lin K J， Li F， Hou M L. 2011. The biological effects of transgenic rice varieties with cry1C or cry2A on the non-target insect pest Laodelphax striatellus[J]. Plant Protection， 37（6）： 120-125.

張學(xué)明，宋陽，張丕武，馬建，晏佳琳，付永平，曲靜，張卓，董環(huán)，李琦. 2015. 大豆凝集素和脂肪氧化酶雙價RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報， 43（7）： 1-7.

Zhang X M， Song Y， Zhang P W， Ma J， Yan J L， Fu Y P， Qu J， Zhang Z， Dong H， Li Q. 2015. Construction of RNAi expression vector of soybean agglutinin and lipoxygenase inhibitor genes and its transformation[J]. Journal of Northwest A&F University， 43（7）： 1-7.

趙歡， 彭正松. 2014.半夏屬植物凝集素的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 26（9）： 1531-1537.

Zhao H， Peng Z S. 2014. Review on studies of agglutinins in Pinellia[J]. Natural Product Research and Development， 26（9）： 1531-1537.

朱禎. 2010. 轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報， 12（2）： 9-16.

Zhu Z. 2010. Progress in research and development of transgenic rice[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 12（2）： 9-16.

Datta K， Vasquez A， Tu J. 1998. Constitutive and tissue-specific differential expression of the cryIA（b） gene in transgenic rice plants conferring resistance to rice insect pest[J]. Theoretical and Applied Genetics，97（1）：20-30.

Sambrook J， David W R. 2002 . Molecular cloning a laboratory manual[M]. The 3rd Edition. Beijing： Science Press： 32-34.

Xiao Y， Wang K， Ding R X. 2012. Transgenic tetraploid Isatis indigotica expressing Bt Cry1Ac and Pinellia ternata agglutinin showed enhanced resistance to moths and aphids[J].Molecular Biology Reports， 39（1）： 485-491.

Yu Y， Wei Z M. 2008. Increased oriental army worm and aphidresistance in transgenic wheat stably expressing Bacillus thuringiensis（Bt） endotoxin and Pinellia ternate agglutinin（PTA）[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 94（1）： 33-44.

（責(zé)任編輯 陳 燕）