嚴(yán)華兵 周慧文 單建偉 謝向譽(yù)

摘要：【目的】優(yōu)化木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行SCoT引物篩選，為木薯輔助育種提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳阅臼砥贩N新選048為材料，利用正交試驗設(shè)計對DNA模板量、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶量等因素進(jìn)行優(yōu)化，確定木薯最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系，并用其進(jìn)行SCoT引物篩選。【結(jié)果】木薯最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：模板DNA 60 ng，引物濃度0.30 μmol/L，Taq DNA聚合酶 1.5 U，Mg2+ 1.50 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L。利用該體系篩選出19條SCoT引物，能穩(wěn)定擴(kuò)增出數(shù)量多、清晰可辨且多態(tài)性豐富的條帶?！窘Y(jié)論】優(yōu)化的木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系檢測結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，且篩選出的19條引物均適用于木薯遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞： 木薯；SCoT-PCR反應(yīng)體系；正交試驗設(shè)計；引物篩選

中圖分類號： S533 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1648-05

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲等100余個國家和地區(qū)（El-Sharkawy，2004），是世界三大薯類作物之一。廣西木薯種植面積及產(chǎn)量均占我國總量的50%～60%，通過木薯育種提高木薯產(chǎn)量對廣西乃至全國木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義。木薯遺傳背景復(fù)雜，雜合度高，為其品種選育提供了豐富的遺傳資源。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于木薯親本的選擇、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等研究。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（Start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard和Mackill（2009）以水稻為基礎(chǔ)提出的基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)（SPAR）的新目的基因分子標(biāo)記，其原理是基于植物基因中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計單引物并對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，具有操作簡單、引物通用、成本低廉、多態(tài)性高、能獲得豐富遺傳信息等優(yōu)點(diǎn)（熊發(fā)前等，2009）。SCoT分子標(biāo)記是以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，建立穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系能更好地利用SCoT分子標(biāo)記。因此，開展木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化與引物篩選研究，對木薯分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有大量分子標(biāo)記應(yīng)用于木薯研究。Beeching等（1993）利用RFLP分子標(biāo)記對木薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析；曾霞等（2003）利用RAPD分子標(biāo)記對44份木薯材料進(jìn)行遺傳背景研究；韋祖生等（2008）利用EST-SSR分子標(biāo)記對國內(nèi)原始材料和引進(jìn)材料進(jìn)行 遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新引進(jìn)材料有新的遺傳類型；陳青等（2013）利用EST-SSR、SSR和SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建木薯遺傳連鎖圖譜。自2009年SCoT分子標(biāo)記被開發(fā)以來，侯小改等（2009）、韓國輝等（2011）、趙瑞強(qiáng)等（2012）分別對牡丹、柑橘、鐵皮石斛等作物的SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化；黃秀等（2013）、李丕睿等（2013）、楊祥燕等（2013）、蔣雅琴等（2014）分別應(yīng)用該技術(shù)對高牛鞭草、菊花、番木瓜、絲瓜等作物進(jìn)行遺傳多樣性分析；此外，也有研究將該技術(shù)應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、基因差異表達(dá)分析及指紋圖譜和分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建（龍治堅等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，研究木薯的分子標(biāo)記多為EST-SSR、SSR等，鮮見利用SCoT分子標(biāo)記開展木薯PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用正交試驗設(shè)計對影響木薯SCoT-PCR擴(kuò)增效果的Mg2+濃度、DNA模板量、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶量5個因素進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳的木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系，并利用該體系對36條SCoT引物進(jìn)行篩選，為利用SCoT分子標(biāo)記進(jìn)行木薯輔助育種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

20份木薯材料（表1）采集自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建木薯育種基地。所用的36條SCoT引物序列（表2）參照Collard和Mackill（2009），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。瓊脂糖、dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑及藥品均購自寶生物工程（大連）有限公司。主要儀器設(shè)備：Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、HAD-JY600C三恒電泳儀（北京亞歐德鵬科技有限公司）、DYCP- 31DN型電泳槽（北京六一儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 采集無病蟲害木薯健康植株幼嫩葉片并提取其DNA，DNA提取參考改良CTAB提取法（閆慶祥等，2010）。用紫外分光光度計檢測DNA濃度，并將提取的DNA稀釋成30 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 正交試驗設(shè)計 選擇DNA模板、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶量等5個因素，每因素設(shè)4個水平，進(jìn)行L16（45）正交試驗（表3），共16個組合，每個組合設(shè)3次重復(fù)，且每個組合加入2.0 μL 10×Mg2+ Free PCR Buffer，并用ddH2O補(bǔ)至20.0 μL。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增與檢測 經(jīng)初步篩選，選取SC21為正交試驗引物，木薯品種新選048的DNA為模板。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，設(shè)定電壓為120 V，運(yùn)行時間為30 min。經(jīng)GoldView核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)成像后拍照。

1. 2. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 根據(jù)電泳圖譜中的電泳條帶數(shù)目、清晰度及背景干凈程度進(jìn)行打分，參照何正文等（1998）、謝云海等（2005）的直觀分析法，條帶清晰、數(shù)目豐富、背景干凈的記為最高分（16分），反之記為最低分（1分）。最后用Excel 2007計算平均分、極差及制作圖表。

1. 2. 5 體系檢驗及引物篩選 以SC21為引物，20份木薯材料的DNA為模板，對優(yōu)化SCoT-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性及擴(kuò)增效果進(jìn)行驗證。并以新選048的DNA為模板，使用優(yōu)化的SCoT-PCR反應(yīng)體系從Collard和Mackill（2009）設(shè)計的36條引物中篩選適用于木薯的SCoT引物。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR反應(yīng)體系的正交試驗結(jié)果

從圖1可看出，16個組合的擴(kuò)增效果各不相同。利用直觀分析法對其進(jìn)行打分（表4），由于R越大，表明該因素對SCoT-PCR反應(yīng)體系影響越大；Ki越大，則表示該水平越好（桂騰琴等，2009），因此，5個因素對SCoT-PCR反應(yīng)體系的影響排序為：dNTPs濃度>Mg2+濃度>引物濃度>Taq DNA聚合酶量>DNA模板量，結(jié)合Ki可初步確定最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：dNTPs 0.25 mmol/L，Mg2+1.50 mmol/L，引物濃度0.30 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA模板60 ng。

2. 2 體系驗證結(jié)果

用SC21引物對20份木薯材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，條帶清晰、數(shù)目豐富，背景干凈，且從不同木薯材料中擴(kuò)增出多態(tài)性片段，表明優(yōu)化后的SCoT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增效果良好且穩(wěn)定，可應(yīng)用于木薯親本的選擇、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等研究。

2. 3 引物篩選結(jié)果

利用優(yōu)化的木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系，以新選048的DNA為模板，對Collard和Mackill（2009）報道的36條引物進(jìn)行篩選，以期篩選出適用于木薯的SCoT引物，結(jié)果如圖3所示，有19條引物能穩(wěn)定地擴(kuò)增出數(shù)量多、清晰可辨且多態(tài)性豐富的條帶。

3 討論

將正交試驗設(shè)計應(yīng)用于SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化在國內(nèi)最早由何正文等（1998）提出。在此之前的PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究采用多次單因素試驗，只變化一個因素而固定其他因素，僅靠經(jīng)驗或參照相近物種確定因素變化范圍，未能考察PCR反應(yīng)體系中各因素的交互作用，從而無法準(zhǔn)確獲得各因素最佳水平組合（楊水云等，2005）。以正交試驗設(shè)計優(yōu)化PCR反應(yīng)體系省工省時，試驗成本低，且兼顧各因素的交互作用，目前已有大量研究利用該方法優(yōu)化了牡丹（侯小改等，2011）、柑橘（韓國輝等，2011）、苜蓿（何慶元等，2012）、鐵皮石斛（趙瑞強(qiáng)等，2012）、菊（李丕睿等，2013）、柿（夏樂晗等，2014）等作物的SCoT-PCR反應(yīng)體系。本研究采用正交試驗設(shè)計，快速獲得最佳的木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系，彌補(bǔ)了應(yīng)用正交試驗設(shè)計優(yōu)化木薯SCoT-PCR反應(yīng)體系的空白。

SCoT是一種基于PCR擴(kuò)增的目的基因分子標(biāo)記，而PCR是一個受多因素影響的綜合反應(yīng)體系（趙瑞強(qiáng)等，2012），因此建立最佳PCR反應(yīng)體系對試驗順利開展尤為重要。影響SCoT-PCR擴(kuò)增效果的主要因素因作物而異，如對于牡丹而言，Mg2+濃度是對SCoT- PCR擴(kuò)增效果影響最主要的因素（侯小改等，2011）；而對于鐵皮石斛而言，Taq DNA聚合酶量是最主要的因素（趙瑞強(qiáng)等，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度對木薯SCoT-PCR擴(kuò)增效果影響最大，與柑橘（韓國輝等，2011）的相同，其次是Mg2+濃度。

4 結(jié)論

木薯最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：DNA模板60 ng，引物濃度0.30 μmol/L，Taq DNA聚合酶量1.5 U，Mg2+濃度1.50 mmol/L，dNTPs濃度0.25 mmol/L，且篩選出的19條引物均適用于木薯遺傳多樣性分析，可為木薯的分子輔助育種提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）