利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測蝴蝶蘭組培突變體

肖文芳 李佐 陳和明 呂復(fù)兵

摘 要 以8份蝴蝶蘭種質(zhì)資源為材料，使用SSR標(biāo)記進(jìn)行蝴蝶蘭種質(zhì)資源和突變體的鑒定。從25對SSR熒光標(biāo)記引物中篩選出10對擴(kuò)增效果理想的SSR熒光標(biāo)記引物，鑒定4個不同品種的蝴蝶蘭及其相應(yīng)的突變體。10對SSR引物中有9對引物在這8個種質(zhì)中能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，共擴(kuò)增出38個等位基因，利用其中3對引物SSR3+SSR8+SSR9的組合即可將4個品種及其突變體全部區(qū)分開，說明SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測蝴蝶蘭突變體高效可行。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；組培突變體；SSR

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In this research， four Phalaenopsis germplasms and their somaclonal mutants were used to identity mutants by fluorescent labeled simple sequence repeat（SSR）markers. Ten of 25 SSR primer pairs with good repeatability were selected，and then were labeled with fluorescent for amplification and capillary electrophoresis. Nine of 10 SSR primer pairs with high polymorphisms totally amplified 38 polymorphic alleles. SSR3， SSR8 and SSR9 could distinguish all of the samples. The present results provide valuable tools for the cultivar classification and somaclonal variation detection of Phalaenopsis.

Key Words Phalaenopsis； Somaclonal variation； SSR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.015

微衛(wèi)星（Microsatellite），也稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats， STRs）或簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSRs），是指以幾個核苷酸（2～5個）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個核苷酸的重復(fù)序列。微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物整個基因組的不同位置上，由于重復(fù)次數(shù)的不同及重復(fù)程度的不完全造成了每個位點的多態(tài)性。SSR具有信息含量高、呈共顯性遺傳，檢測時DNA用量少、操作簡便、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點，是分析種質(zhì)資源遺傳多樣性，進(jìn)行基因組作圖的重要手段。傳統(tǒng)的SSR檢測方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加放射顯影或銀染的方法，費(fèi)時費(fèi)力低效。目前廣泛采用的毛細(xì)管電泳技術(shù)，其原理是利用ABI遺傳分析儀對熒光標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行檢測，結(jié)合分子量內(nèi)標(biāo)進(jìn)行DNA片段長度計算，使SSR分型變得高效快捷，重復(fù)性好，結(jié)果也更加精確。

SSR在蘭科植物上的應(yīng)用不多，主要集中在種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析上[1-5]。

目前，國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）的BMT分子測試指南中將SSR和SNP確定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方法，由于SSR標(biāo)記技術(shù)比較成熟，成為當(dāng)前各個作物建庫的首選標(biāo)記（UPOV，2007），已成功用于構(gòu)建水稻、油菜、棉花、甘蔗、花生、棗、梨、百合等經(jīng)濟(jì)作物的指紋圖譜，其中大部分均采用毛細(xì)管電泳檢測法[6-14]。而在突變體檢測方面，目前主要使用的分子鑒定方法為RAPD[15-16]、AFLP[17]和SSR，其中利用SSR對水稻空間誘變系[18-19]、棉花的組培突變體[20]和大豆的突變體庫[21]進(jìn)行檢測，都得到了較好的檢測結(jié)果，但仍局限于傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測法，未見結(jié)合更高效精確的毛細(xì)管電泳檢測手段。蝴蝶蘭作為重要的觀賞作物，經(jīng)濟(jì)價值非常高，但相對其生產(chǎn)成本也高，生長周期較長，從組培苗到開花售賣約18個月。由于激素使用等原因，蝴蝶蘭種苗在組培生產(chǎn)過程中存在一定的變異幾率，而突變體并不符合商品生產(chǎn)的要求，會加大生產(chǎn)成本，不利于大規(guī)模商品化生產(chǎn)。所以高效的蝴蝶蘭突變體檢測技術(shù)非常必要。

本實驗利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法對已在形態(tài)學(xué)上觀測到突變的蝴蝶蘭突變體進(jìn)行檢測，探索SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法在蝴蝶蘭突變體檢測上的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蝴蝶蘭植株 實驗采用4組相對變異的蝴蝶蘭突變體及其野生型，第1組為市場流行品種‘滿天紅及其具白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第2組為市場流行品種‘光芒四射及其無白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第3組為市場流行品種‘V31及其具白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第4組為本單位自主選育和審定的蝴蝶蘭紅花品種‘紅珍珠（粵審花2007004）及其晚花突變體（見圖1）。突變體均為本單位在組培及栽培過程中發(fā)現(xiàn)的自有突變體，經(jīng)多年觀察及繁殖發(fā)現(xiàn)突變體的性狀均能穩(wěn)定遺傳。所有實驗材料均種植于廣東省農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化科技示范區(qū)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚內(nèi)，棚內(nèi)有專職人員種植養(yǎng)護(hù)。

1.1.2 試劑 化學(xué)試劑均購自廣州化學(xué)試劑廠；基因組DNA提取試劑盒為天根生物科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒；擴(kuò)增試劑：2.5×Multiplex Buffer及Fast Taq DNA Polymerase來自北京閱微基因公司；ROX-500和ROX-800分子量內(nèi)標(biāo)來自北京閱微基因公司。

1.1.3 儀器 （1）Nanodrop 2000C核酸蛋白檢測系統(tǒng)（Thermo）；（2）BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；（3）BioSens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；（4）Centrifuge 5415D離心機(jī)（德國eppendorf公司）；（5）GeneAmp 9600 PCR儀（ABI公司）；（6）3730XL DNA analyzer（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 蝴蝶蘭基因組DNA提取材料采用根尖0.2 g，按照天根生物科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行，提取的DNA溶解在80 μL 1×TE溶液中。提取的DNA分別采用分光光度計檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 引物合成 引物分別采用3種不同顏色的熒光標(biāo)記：FAM、HEX和TMR。根據(jù)前人研究結(jié)果，挑選了25條在蝴蝶蘭中擴(kuò)增效果較好的引物進(jìn)行擴(kuò)增[5，22-24]，擴(kuò)增產(chǎn)物大小介于150～750 bp之間，預(yù)測多集中于250～550 bp之間。經(jīng)過篩選，其中10條引物（見表1）在本實驗中擴(kuò)增結(jié)果較好，無雜峰，能擴(kuò)增出穩(wěn)定的DNA條帶。

1.2.3 PCR反應(yīng) 進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為15 μL，其中含1.0 μL（50 ng/μL）DNA模板，6.0 μL 2.5×Buffer V緩沖液，0.1 μL（5 U/μL）Taq酶，上下游引物共1.0 μL（5 μmol/L），去離子水6.9 μL。SSR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，35個循環(huán)；72 ℃ 35 s，60 ℃ 30 min，1個循環(huán)，最后降至15 ℃。

1.2.4 測序儀檢測及分析 96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5 ∶ 8.5）9 μL，PCR產(chǎn)物1.0 μL，95 ℃變性3 min后，上機(jī)進(jìn)行多重混檢。1 kV電壓進(jìn)樣10 s，電泳15 kV，30 min。將Data Colletion軟件收集的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入GeneMapper v4.0軟件進(jìn)行分析，系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中的ROX-500或ROX-800分子量內(nèi)標(biāo)予以比較，直接給出目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小。各熒光標(biāo)記座位上獨(dú)立進(jìn)行3次重復(fù)的毛細(xì)管電泳檢測，取3次重復(fù)的平均值并四舍五入取整，作為實驗材料在該座位上的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，基于8個實驗材料，10個SSR熒光標(biāo)記共檢測到38個等位基因（見表2，圖2）。10個SSR熒光標(biāo)記中只有SSR4沒有多態(tài)性，其余引物均能在一定程度上將各個品種或者正常株與突變體之間區(qū)分開。其中，SSR1和SSR6能夠?qū)ⅰ疂M天紅及其變異株與其他的品種區(qū)分開，但是‘滿天紅及其變異株之間未能區(qū)分。SSR2不能區(qū)分‘紅珍珠及其變異株，但能將二者與其他的品種區(qū)分開。SSR3在‘滿天紅上表現(xiàn)出特異性缺失，而在‘滿天紅變異中則擴(kuò)增出1條234 bp的條帶；在‘V31及其變異間檢測不到多態(tài)性，但是與其他3個品種有所區(qū)分；能夠?qū)ⅰ饷⑺纳浜汀t珍珠這2個品種、‘光芒四射及其變異區(qū)分開，但是不能將‘紅珍珠及其變異區(qū)分開。SSR5的結(jié)果將8個品種分為3組，滿天紅及其變異株條帶一樣，‘V31及其變異株條帶一樣，而剩下的4個品種條帶一樣。SSR7則能將4個品種都分開，但是每個品種與其變異株之間都不能檢測出差異。SSR8即能把‘滿天紅、‘V31和‘光芒四射3個品種區(qū)分開，又能把3個品種與他們的突變體區(qū)分開。SSR9能夠?qū)?個品種區(qū)分開，但在突變體區(qū)分中只能將‘紅珍珠及其突變體區(qū)分開。SSR10可以將‘滿天紅及其突變體和‘V31及其突變體區(qū)分開，而‘滿天紅、‘V31和‘光芒四射3個品種的擴(kuò)增條帶各不相同，‘紅珍珠的擴(kuò)增條帶則與‘V31一樣。

SSR3擴(kuò)增‘滿天紅時和SSR9擴(kuò)增‘光芒四射變異時都出現(xiàn)了特異性缺失，不能擴(kuò)增出條帶，可能的原因有2種：（1）該SSR位點由于插入或者缺失而導(dǎo)致該位點缺失；（2）可能是該SSR位點的引物結(jié)合區(qū)發(fā)生點突變，導(dǎo)致引物不能結(jié)合。

從擴(kuò)增結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，10個SSR引物中，SSR3+SSR8+SSR9的組合就能夠完全將4個品種及其突變體全部區(qū)分開，說明SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測蝴蝶蘭突變體高效可行。

3 討論與結(jié)論

突變體的產(chǎn)生主要來源于物理化學(xué)因素、組織培養(yǎng)和太空誘發(fā)[25-26]。蝴蝶蘭這類采用組培繁殖種苗的觀賞作物，其突變體除人為進(jìn)行外，主要來源于組織培養(yǎng)。突變體鑒定方法共4種：（1）表型鑒定；（2）細(xì)胞學(xué)鑒定；（3）生物化學(xué)鑒定；（4）分子生物學(xué)鑒定。各種方法都有自己的優(yōu)點和適用性。在蝴蝶蘭的突變體鑒定上，我們主要采用表型鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，通過表型鑒定發(fā)現(xiàn)突變體，然后利用RAPD[27]或SSR等分子標(biāo)記手段進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，即首先通過表型鑒定篩選出相對于野生型有顯著差異外觀性狀的突變體，然后通過分子鑒定確定其從基因組水平上發(fā)生了變異，最終確定突變體為不受環(huán)境因素影響的可遺傳突變體。

本研究通過對4個蝴蝶蘭品種及其組培突變體的SSR分析，發(fā)現(xiàn)不同品種間及正常株與突變體間在一些SSR位點的基因型差異明顯，說明SSR標(biāo)記可用于蝴蝶蘭組培突變體鑒別及品種鑒定。通過擴(kuò)增結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雖然‘滿天紅及其突變體與V31及其突變體、‘光芒四射及其突變體的表型變異類似，均表現(xiàn)為紅色的增多或者減少，但是擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶卻完全不同，說明3個突變體的變異可能是由不同的基因突變引起的。Su等[28]從蝴蝶蘭中克隆到F3′5′H基因的cDNA全長，利用基因槍法在蝴蝶蘭的花瓣中瞬時表達(dá)，花瓣在48 h內(nèi)從粉紅色變成品紅色，說明F3′5′H基因的上調(diào)可能引起紅色素的增加；Han等[29]將pchs-1全長基因轉(zhuǎn)化到煙草中發(fā)現(xiàn)花的顏色變紅從而進(jìn)一步證明了Pchs基因可能參與花朵的紅色素合成；是形成穩(wěn)定花色素苷所必需的。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在紅花蝴蝶蘭中類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）基因大量表達(dá)，表達(dá)量顯著高于白花，而PeUFGT3-RNAi植株則表現(xiàn)出不同程度的褪色，且花青素含量明顯降低，說明UFGT基因與紅色花的形成高度相關(guān)。這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)變化都有可能引起花部色素含量的變化，進(jìn)而導(dǎo)致花色的改變，另外調(diào)控花青素苷生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因時空表達(dá)的3種轉(zhuǎn)錄因子R2R3-Myb、Myc基因家族的bHLH（basic helix-loop-helix）和WD40型轉(zhuǎn)錄因子[31]的變化也會引起花色的改變，所以三個突變體的表型雖然類似，成因卻各不相同。而‘紅珍珠晚花突變體的成因則可能與FT、SOC1和LFY等成花基因[32]的突變相關(guān)，Xiang等[33]從春蘭中克隆的FT同源基因CgFT在煙草中超量表達(dá)會出現(xiàn)早花表型，Huang等[34]從春蘭克隆的FT同源基因CgFT在擬南芥中超量表達(dá)會也導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開花，說明FT基因會抑制成花，其突變體可能就會是晚花突變體。

從本實驗結(jié)果來看，在實際應(yīng)用方面，前期的蝴蝶蘭高效檢測突變體技術(shù)非常必要。（1）從種質(zhì)資源的收集利用來講，需要通過高效分子標(biāo)記檢測表型相同或者不同的各類突變體來篩選出不同基因型的突變體，豐富種質(zhì)資源的收集保存，減小重復(fù)保存，擴(kuò)大相同表型的不同基因型種質(zhì)資源，為蝴蝶蘭的分子生物學(xué)研究和生理生化研究奠定堅實的資源基礎(chǔ)；（2）從實際生產(chǎn)上來講，蝴蝶蘭由于生產(chǎn)規(guī)模大、成本高，在前期進(jìn)行抽樣檢測，保證種苗的品種純正非常必要。從本實驗的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，大部分的SSR特異性片段間大小的差異較小，有的小到只差2 bp，傳統(tǒng)的SSR檢測方法根本不能檢測到如此小的差異，毛細(xì)管電泳技術(shù)則能夠檢測小到1 bp的差異，使SSR分型變得高效快捷，實用性也更強(qiáng)，更適用于蝴蝶蘭的品種及突變體檢測鑒定。

當(dāng)然，用分子標(biāo)記對種質(zhì)進(jìn)行鑒定目前還處于研究階段，還存在不少問題，特別對于蝴蝶蘭這種原生種眾多、高度雜合的物種，基因組參考性較差，設(shè)計的引物并不一定和重要的形態(tài)性狀連鎖，并不能完全包含一個品種的所有信息。本實驗發(fā)現(xiàn)，針對大規(guī)模的生產(chǎn)檢測，SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測行之有效且高效低投入。但是如果是針對生物學(xué)實驗材料的鑒定檢測，還應(yīng)與染色體水平、細(xì)胞學(xué)水平和形態(tài)水平等鑒定相結(jié)合，才能更加準(zhǔn)確地描述一個品種的全部種質(zhì)信息。

參考文獻(xiàn)

[1] 張君毅， 陳瑞鳳. 蝴蝶蘭EST-SSRs分析[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2010， 46（6）： 559-563.

[2] Huang Y， Li F， Chen K S. Analysis of Diversity and relationships among Chinese orchid cultivars[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2010， 38： 93-102.

[3] 張君毅. 蝴蝶蘭葉綠體DNA微衛(wèi)星分析與標(biāo)記開發(fā)[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2011， 23（12）： 31-33.

[4] 徐曉薇， 江 南， 楊俊波， 等. 寒蘭株系間遺傳多樣性和親緣關(guān)系的SSR分子標(biāo)記分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2011， 25（6）： 1 135-1 141.

[5] 張水明， 陳 程， 龔凌燕， 等. 蝴蝶蘭EST資源SSR標(biāo)記分析與開發(fā)[J]. 園藝學(xué)報， 2012， 23 （12）： 31-33.

[6] 程本義， 夏俊輝， 龔俊義， 等. SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測法在水稻DNA指紋鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國水稻科學(xué)， 2011， 25（6）： 672-676.

[7] 許 鯤， 李 鋒， 吳金鋒， 等. SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法與國家冬油菜區(qū)試指紋鑒定平臺的構(gòu)建[J]. 中國油料作物學(xué)報， 2014， 36（2）： 150-159.

[8] 聶新輝， 尤春源， 李曉方， 等. 新陸早棉花品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 作物學(xué)報， 2014， 40（12）： 2 104-2 117.

[9] 匡 猛， 楊偉華， 許紅霞， 等. 中國棉花主栽品種DNA 指紋圖譜構(gòu)建及SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44（1）： 20-27.

[10] 梁 俊， PAN Yong-Bao， 李楊瑞， 等. 甘蔗屬不同種及優(yōu)良甘蔗栽培品種的SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 廣西植物， 2010， 30（5）： 594-600.

[11] 閆彩霞， 張 浩， 張廷婷， 等. 抗感黃曲霉花生種質(zhì)遺傳多樣性評價與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 48（1）： 1-6.

[12] 麻麗穎， 孔德倉， 劉華波， 等. 36 份棗品種SSR 指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 園藝學(xué)報， 2012， 39（4）： 647-654.

[13] 高 源， 田路明， 劉鳳之， 等. 利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建92個梨品種指紋圖譜[J]. 園藝學(xué)報， 2012， 39（8）： 1 437-1 446.

[14] 徐雷鋒， 葛 亮， 袁素霞， 等. 利用熒光標(biāo)記SSR構(gòu)建百合種質(zhì)資源分子身份證[J]. 園藝學(xué)報， 2014， 41（10）： 2 055-2 064.

[15] 殷冬梅， 楊秋云， 楊海棠， 等. 花生突變體的EMS誘變及分子檢測[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2009， 25（5）： 53-56.

[16] 喬 勇. 60Co-γ射線輻照后不同唐菖蒲品種M2代生物學(xué)特性的變化及突變體檢測研究[D]. 陜西： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2008.

[17] 蘇玉環(huán). 太空誘變西瓜突變體檢測及相關(guān)片段的克隆[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008.

[18] 王 豐， 李永輝， 柳武革， 等. 水稻不育系培矮生645的空間誘變效應(yīng)及后代的SSR分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2006， 20（6）： 449-453.

[19] 楊存義， 陳芳遠(yuǎn)， 王應(yīng)祥， 等. 粳稻品種秋光空間誘變突變體的微衛(wèi)星分析[J]. 西北植物學(xué)報， 2003， 23（9）： 1 550-1 555.

[20] Shuangxia Jin， Ramesh Mushke， Huaguo Zhu， et al. Detection of somaclonal variation of cotton（Gossypium hirsutum） using cytogenetics， Flow Cytometry and Molecular Markers[J]. Plant Cell Rep， 2008， 27： 1 303-1 316.

[21] 黃益安， 鄧小娟， 萬海波， 等. 大豆華夏3 號突變體庫構(gòu)建及SSR分子標(biāo)記[J]. 中國油料作物學(xué)報， 2016， 38（2）： 159-166.

[22] 李冬梅， 呂復(fù)兵， 朱根發(fā)， 等. 蝴蝶蘭EST資源的SSR信息分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 3： 117-120.

[23] Fattmah， Sukma D. Development of sequence-based microsatellite marker for Phalaenopsis， orchid[J]. Hayati Journal of Biosciences， 2011， 18（2）： 71-76.

[24] Rodrigues K F， Kumar S V. Isolation and characterization of microsatellite loci in Phalaenopsis gigantea[J]. Conserv Genet， 2009， 10： 559-562.

[25] 穆麗霞， 何曉明， 王小菁.植物抗性突變體離體篩選和鑒定研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006（1）： 30-33.

[26] 王浩波， 高秀武， 谷運(yùn)紅， 等. 離子束誘變西瓜體細(xì)胞抗鐮刀菌酸突變體研究[J]. 核技術(shù)， 2003， 26： 609-612.

[27] 肖文芳， 李 佐， 尤 毅， 等. 幾種常見蝴蝶蘭組培突變體的RAPD檢測[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2013， 34（6）： 1 110-1 114.

[28] Su V， Hsu B D. Cloning and expression of a putative cytochrome P450 gene that influences the color of Phalaenopsis flowers[J]. Biotechnol Lett， 2003， 25（22）： 1 933-1 939.

[29] Han Y Y， Ming F， Wang J W， et al. A novel chalcone synthase gene from Phalaenopsis orchid that alters floral morphology in transgenic tobacco plants[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2005， 23： 193-193.

[30] Chen W H， Hsu C Y， Cheng H Y， et al. Downregulation of putative UDP-glucose： flavonoid 3-O-glucosyltransferase gene alters flower coloring in Phalaenopsis[J]. Plant Cell Reports， 2011， 30（6）： 1 007-1 017.

[31] Tanaka Y， Sasaki N， Ohmiya A. Biosynthesis of plant pigments： anthocyanins， betalains and carotenoids[J]. The Plant Journal，2008， 54（4）： 733-749.

[32] Moon J， Lee H， Kim M， et al. Analysis of flowering pathway integrators in Arabidopsis[J]. Plant & Cell Physiology， 2005， 46（2）： 292-299.

[33] Xiang L， Li X， Qin D， et al. Functional analysis of FLOWERING LOCUS T orthologs from spring orchid（Cymbidium goeringii Rchb. f.）that regulates the vegetative to reproductive transition[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2012， 58： 98-105.

[34] Huang W， Fang Z， Zeng S， et al. Molecular cloning and functional analysis of three FLOWERING LOCUS T（FT）homologous genes from Chinese Cymbidium[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2012， 13（9）： 11 385-11 398.