朱東姿 宗曉娟 陳新 王甲威 徐麗 魏海蓉 譚鉞 劉慶忠

摘要：為保持甜櫻桃矮化砧木吉塞拉的遺傳穩(wěn)定性和避免種質(zhì)遺傳資源丟失，以玻璃化法超低溫冷凍保存過程中涉及的主要因子設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，摸索適合吉塞拉的最佳保存體系；設(shè)計(jì)單因子試驗(yàn)，觀察不同單因子對吉塞拉超低溫冷凍保存的影響。結(jié)果表明，取生長90 d的組培苗于4 ℃低溫鍛煉3周或4周，剝?nèi)∏o尖放于含0.3 mol/L蔗糖的預(yù)培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)1 d，在裝載液中滲透30 min，用PVS3玻璃化試劑0 ℃處理60 min后投入到液氮中保存24 h，取出后經(jīng)40 ℃水浴快速化凍1 min，卸載液洗滌兩次，每次10 min，后置于恢復(fù)培養(yǎng)基上，莖尖的存活率最高且遺傳穩(wěn)定性好。本試驗(yàn)成功建立了甜櫻桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化法超低溫保存技術(shù)，為甜櫻桃種質(zhì)資源的長期保存提供了一條有效途徑。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；矮化砧木；吉塞拉；莖尖；超低溫冷凍保存；玻璃化法

中圖分類號：S662.509+.3文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0134-07

我國具有豐富的櫻桃種質(zhì)資源，包括本土的中國櫻桃和引進(jìn)的甜櫻桃品種及砧木資源，這些是進(jìn)行抗性育種的基因庫及進(jìn)行種質(zhì)改良的基礎(chǔ)[1]。然而建立一個櫻桃種質(zhì)資源圃需要投入大量的人力、物力和土地[2]。因此，投入少、占地少且長期穩(wěn)定的種質(zhì)資源超低溫冷凍保存方法逐漸被公認(rèn)[3-5]，尤其是對果樹等木本植物的保存。大多數(shù)果樹由于其遺傳與繁殖特點(diǎn)不能用種子進(jìn)行保存，而以活體資源圃的方式保存又存在諸多問題，如成本高、效率低，且種質(zhì)資源在保存過程中易發(fā)生變異等[6，7]。迄今已有10多種果樹莖尖的超低溫保存獲得了成功，如蘋果、杏、柑橘、桃、柿子等[8-12]。與蘋果、杏等果樹的超低溫保存研究相比，櫻桃超低溫保存的研究較少，趙艷華等[13]用玻璃化法成功保存了馬哈利櫻桃的離體莖尖；Niino等[14]用玻璃化一步法成功保存了日本山櫻、大島櫻及大紫甜櫻桃等的離體莖尖。吉塞拉（Gisela）砧木是德國吉森大學(xué)以酸櫻桃（Prunus cerasus L.）和灰毛葉櫻桃（P. canescens L.）為親本種間雜交得到的三倍體雜種矮化砧木[15]。吉塞拉樹體開張，分枝基角大，在歐洲、北美應(yīng)用廣泛[16，17]。吉塞拉引進(jìn)我國后與大多數(shù)甜櫻桃品種親合性良好，具有明顯的矮化、豐產(chǎn)、早實(shí)性強(qiáng)、抗病、抗寒、土壤適應(yīng)范圍廣等優(yōu)良特性[18-20]。吉塞拉的引進(jìn)及推廣利用有利于克服我國甜櫻桃生產(chǎn)的樹體高大、難于管理等問題。然而隨著現(xiàn)代甜櫻桃生產(chǎn)的發(fā)展，矮化砧木品種在大范圍內(nèi)推廣，原始品種和地方育種優(yōu)系被陸續(xù)淘汰，這一方面改良了砧木，另一方面也造成了甜櫻桃砧木種質(zhì)資源的貧乏。

因此筆者嘗試以甜櫻桃矮化砧木吉塞拉為材料來研究櫻桃的超低溫冷凍保存技術(shù)，通過改進(jìn)玻璃化法超低溫保存條件，在保證吉塞拉種質(zhì)資源遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，提高冷凍保存的效率及穩(wěn)定性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以甜櫻桃矮化砧木吉塞拉5和吉塞拉6的離體莖尖為材料，組培苗在繼代培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+0.5 mol/L 蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8）上生長90 d，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照強(qiáng)度75 μmo1/（m2·s），光周期16 h/d。

1.2試劑

預(yù)培養(yǎng)液（蔗糖梯度）：MS+0～1.2 mol/L蔗糖；裝載液：MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖；PVS2：MS+30%（W/V）甘油+15%（W/V）乙二醇+15%（W/V）二甲基亞砜+0.4 mol/L蔗糖；PVS3：50% （W/V）甘油+50% （W/V）蔗糖；卸載液：MS+1.2 mol/L蔗糖?；謴?fù)培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L BA+0.5 mol/L 蔗糖+0.7%瓊脂（pH=5.8）。Tiangen PCR mix；天根公司的快捷型植物基因組提取試劑盒（非離心柱型）；SSR引物由上海生工合成；PAGE凝膠所用藥品均購買于上海生工。

1.3正交設(shè)計(jì)

根據(jù)L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以吉塞拉5為材料，選擇低溫鍛煉時間、預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時間三因素，每因素設(shè)計(jì)三水平，共9組試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，取平均值。利用SPSS 11.5軟件和Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

1.4吉塞拉莖尖玻璃化法超低溫保存步驟

取繼代生長90 d的組培苗于4 ℃光照培養(yǎng)箱中低溫鍛煉0～10周。取帶頂芽的莖段，在顯微鏡下剝?nèi)￠L度約1.5 mm的莖尖（不大于2 mm，一般含1～2個葉原基），放入預(yù)培養(yǎng)液中1～5 d，每組莖尖不低于30個；莖尖經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后，放入裝載液中，室溫靜置30 min；去除裝載液，加入玻璃化溶液PVS2或PVS3，在0 ℃條件下放置30～90 min；吸掉玻璃化溶液，重新加入適量玻璃化溶液至恰好浸沒莖尖，將凍存管放入液氮中冷凍5 min，再轉(zhuǎn)移到大液氮罐中保存。從液氮罐中將冷凍24 h的凍存管取出，迅速放入40 ℃溫水中快速化凍1 min，加入卸載液，洗滌兩次，每次10 min，將莖尖轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光周期12 h/d，光照強(qiáng)度75 μmo1/（m2·s）。

光培養(yǎng)恢復(fù)2周后統(tǒng)計(jì)存活率，莖尖保持綠色或黃綠色、長出小葉或者脫分化形成愈傷組織的莖尖均視為存活。存活率（%）=存活的莖尖個數(shù)/總莖尖數(shù)×100，取3次重復(fù)的平均值。

1.5吉塞拉莖尖超低溫保存后再生苗生長情況調(diào)查

選取長勢一致、生長健壯的冷凍前后的吉塞拉5和吉塞拉6擴(kuò)繁材料，接入繼代培養(yǎng)基，每品種接6瓶，每瓶接4個芽，同品種放置在同一架面培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照強(qiáng)度75 μmo1/（m2·s），光周期16 h/d。40 d后，取出材料調(diào)查再生苗生長情況。

1.6吉塞拉莖尖超低溫保存后遺傳穩(wěn)定性的分子檢測

1.6.1組培苗材料基因組DNA的提取使用天根公司的快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）試劑盒提取組培苗葉片的全基因組，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.6.2SSR分子標(biāo)記分析利用17對已發(fā)表的櫻桃常用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21-23]，進(jìn)行引物初篩。PCR反應(yīng)體系：模板2 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，50～60 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共32個循環(huán)；72 ℃加尾5 min；4 ℃保存。

1.6.3聚丙烯酰胺凝膠電泳配制6%聚丙烯酰胺凝膠，恒定功率100 W，電泳2 h。電泳結(jié)束后，將凝膠分離出來，清洗兩次，加入銀染液輕輕搖動20 min，水洗兩次；立即放入顯影液中至DNA條帶顯出，用蒸餾水沖洗，室溫下自然干燥，拍照。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)

對正交試驗(yàn)結(jié)果（表1）進(jìn)行分析，除預(yù)培養(yǎng)時間外，其余兩個因子的結(jié)果都存在顯著差異，最顯著的是低溫鍛煉時間，F(xiàn)值達(dá)到60.61，遠(yuǎn)高于F0.05，但沒有達(dá)到極顯著差異水平；其次是預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度，F(xiàn)值達(dá)到46.14。由正交試驗(yàn)結(jié)果得出，吉塞拉超低溫冷凍保存過程中低溫鍛煉時間、預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時間三個因素的最佳水平分別是4周、0.3 mol/L和1 d。

2.2單因子對吉塞拉玻璃化法超低溫保存的影響

正交試驗(yàn)雖能得到最優(yōu)組合，但單因素具體如何影響超低溫保存仍需進(jìn)一步試驗(yàn)，筆者對低溫鍛煉時間、預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時間和玻璃化溶液及處理時間四個單因素分別進(jìn)行研究。由圖1 A可知，隨著低溫鍛煉時間的延長，吉塞拉5

和吉塞拉6莖尖存活率均呈逐漸上升趨勢。沒有經(jīng)過低溫鍛煉的吉塞拉5和吉塞拉6莖尖存活率分別是45.3%和47.5%，處理1周后的存活率分別是63.6%和68.7%，差異分別達(dá)到顯著和極顯著水平。吉塞拉5低溫處理3周以內(nèi)處理間的差異均達(dá)顯著水平，即存活率升高趨勢較快；低溫處理4周以后處理間的差異不顯著，即低溫處理4周以后莖尖存活率升高趨勢變緩。吉塞拉6低溫處理2周以內(nèi)處理間的差異顯著，處理3周以后處理間差異不顯著。但是隨著低溫鍛煉時間的延長，培養(yǎng)瓶內(nèi)營養(yǎng)、水分減少，組培苗開始萎蔫、發(fā)黃甚至死亡，不利于莖尖的剝?nèi)?，因此吉塞?的低溫鍛煉時間應(yīng)選取在4周，吉塞拉6應(yīng)選取在3周。

由圖1 B可知，吉塞拉莖尖玻璃化法超低溫保存后的存活率隨預(yù)培養(yǎng)時間的延長呈先升高后降低趨勢，預(yù)培養(yǎng)1 d與沒有經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的差異顯著，但預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)間的差異不明顯，預(yù)培養(yǎng)1 d時莖尖存活率最高。

由圖1 C可知，吉塞拉莖尖玻璃化法超低溫保存后的存活率對預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度的變化較敏感。吉塞拉5和吉塞拉6莖尖存活率隨著預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度的上升均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，過高的蔗糖濃度可導(dǎo)致存活率的降低，其中以含有0.3 mol/L蔗糖的預(yù)培養(yǎng)液效果較好，與其他蔗糖濃度預(yù)處理后獲得的存活率呈現(xiàn)顯著或極顯著差異，存活率達(dá)90%以上。

由圖1 D可知，PVS3處理吉塞拉莖尖的存活率明顯較PVS2處理高。另外，處理時間的長短對于存活率的影響不管是在PVS2中還是在PVS3中都有顯著差異，處理60 min時存活率最高。

結(jié)合正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)結(jié)果，吉塞拉超低溫冷凍保存的最佳體系是，剝?nèi)〉蜏劐憻?周的組培苗莖尖，置于含有0.3 mol/L蔗糖的預(yù)培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)1 d，常溫裝載30 min，0℃、PVS3玻璃化溶液處理60 min，在該處理?xiàng)l件下，吉塞拉莖尖的存活率較高。

2.3吉塞拉超低溫冷凍保存后遺傳穩(wěn)定性檢測

從組培苗擴(kuò)繁系數(shù)、生根能力、葉片長寬比、葉片顏色等性狀對保存后的10株吉塞拉5、10株吉塞拉6共20株植株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性鑒定，結(jié)果如表2，與未經(jīng)超低溫冷凍保存的G6組培苗相比，葉片長寬比葉片顏色擴(kuò)繁系數(shù)生根條數(shù)未經(jīng)超低溫冷凍的G6組培苗1.35∶1深綠色12.5±2.19.7±2.4G5保存后1.39∶1深綠色13.4±1.89.2±2.9

G6保存后1.32∶1深綠色12.9±2.410.1±2.9其葉片長寬比、葉片顏色、擴(kuò)繁系數(shù)、生根能力均無明顯區(qū)別。以吉塞拉5為例，甜櫻桃矮化砧木超低溫冷凍保存莖尖再生苗過程如圖2所示。

莖尖經(jīng)過玻璃化法超低溫保存后，再生培養(yǎng)45 d（圖2 D），取不同批次的21株再生苗的葉片，提取基因組DNA，以未經(jīng)超低溫保存處理的組培苗葉片基因組為對照，共22份樣品，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測。利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增體系篩選17對引物，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果選取3對多態(tài)性較高、帶型較清楚、分辨率較高的引物，分別為BPPCT026、BPPCT030、UCD-CH12（表3）。用這3對引物進(jìn)行后續(xù)SSR分析，PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。

由圖3、4可以看出，超低溫保存后的樣品與保存前的樣品沒有出現(xiàn)差異性條帶，說明超低溫保存后再生的植株與未經(jīng)超低溫保存的材料之間沒有發(fā)生遺傳變異。因此，基本可以確定超低溫保存不會改變吉塞拉材料的遺傳穩(wěn)定性。

3討論

為了使保存材料達(dá)到超低溫保存所要求的生理特性，必須對材料進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理總的原則是提高細(xì)胞分裂與分化的同步化，減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，增強(qiáng)植物的抗凍力，在預(yù)培養(yǎng)基中補(bǔ)充山梨醇、蔗糖等滲透劑，對提高細(xì)胞的耐凍力有明顯的作用[24]。一般常見的預(yù)處理有低溫鍛煉、反復(fù)繼代、預(yù)培養(yǎng)三種方法。我們的研究發(fā)現(xiàn)對于吉塞拉的預(yù)處理，以低溫鍛煉最佳，隨著低溫鍛煉時間的延長呈上升趨勢，這與在新疆野蘋果中的發(fā)現(xiàn)不同，新疆野蘋果超低溫冷凍保存的成活率隨著低溫鍛煉時間的延長，成活率呈下降趨勢[12]，這可能與樹種有關(guān)。但是隨著低溫鍛煉時間的延長，培養(yǎng)瓶內(nèi)營養(yǎng)、水分減少，組培苗開始萎蔫、發(fā)黃甚至死亡，不利于莖尖的剝?nèi)　＝Y(jié)合蔗糖預(yù)培養(yǎng)處理，可以將低溫鍛煉的時間縮短到3～4周，大大縮減了試驗(yàn)周期。此外，吉塞拉莖尖超低溫保存成活率隨預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度的增加先增后減，這與香蕉、蘋果莖尖進(jìn)行超低溫保存時的趨勢一致[12，25]。吉塞拉在預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度為0.3 mol/L 時保存效果最好；香蕉、蘋果在0.4 mol/L 時保存效果最好，且蘋果需要預(yù)培養(yǎng)3 d，這與吉塞拉不同。預(yù)培養(yǎng)時間對吉塞拉莖尖成活率的影響不顯著，但對蘋果莖尖成活率卻有很大影響。

本研究還對吉塞拉超低溫保存后的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了檢驗(yàn)，與未冷凍保存材料相比，再生苗擴(kuò)繁系數(shù)、生根能力、葉片長寬比、葉片顏色等方面均無明顯差異。利用SSR分子標(biāo)記從分子水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示超低溫保存后再生的植株沒有發(fā)生遺傳變異。

4結(jié)論

綜上所述，甜櫻桃矮化砧木吉塞拉玻璃化法超低溫保存的最優(yōu)條件是，取生長90 d的組培苗于4℃低溫鍛煉3周或4周（吉塞拉5，4周；吉塞拉6，3周），剝?nèi)∏o尖放于預(yù)培養(yǎng)液中（MS+0.3 mol/L蔗糖）預(yù)培養(yǎng)1 d，在裝載液中滲透30 min，用PVS3玻璃化試劑0 ℃處理60 min后投入到液氮中保存24 h，取出后經(jīng)40 ℃水浴快速化凍1 min，經(jīng)卸載液洗滌兩次，每次10 min，后置于恢復(fù)培養(yǎng)基上，莖尖的存活率最高且遺傳穩(wěn)定性好。

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