吳洪秋， 張永良， 黃堅(jiān)堯， 張漢運(yùn)

珠海市婦幼保健院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 珠海 519001

乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量和HBV DNA定量聯(lián)合檢測(cè)在乙肝病毒感染診斷中的應(yīng)用

吳洪秋， 張永良， 黃堅(jiān)堯， 張漢運(yùn)

珠海市婦幼保健院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 珠海 519001

目的 分析乙肝患者的血清標(biāo)志物和乙肝病毒(HBV)DNA聯(lián)合檢測(cè)在HBV感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 以2013年6月-2015年6月在珠海市婦幼保健院就診的120例乙肝患者血清樣本作為研究資料，分別采用ELISA定性試驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)和HBV DNA含量。結(jié)果 Ⅰ組HBV DNA陽性率為96.15%；Ⅱ組HBV DNA陽性率為48.08%；Ⅲ組HBV DNA陽性率為4.76%。Ⅰ組HBV DNA定量顯著高于Ⅱ、Ⅲ兩組(P<0.01)；Ⅱ組HBV DNA定量顯著高于Ⅲ組(P<0.05)。HBV DNA與HBsAg檢出符合率分別為73.33%和72.50%，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 乙肝血清標(biāo)志物定量與HBV DNA定量聯(lián)合檢測(cè)在診斷HBV感染過程中起互相補(bǔ)充的作用，診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確，可提供更有效的參考依據(jù)。

血清學(xué)標(biāo)志物；HBV DNA；乙肝病毒；定量檢測(cè)

世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)顯示，目前全球有2.4億人是慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者，而每年約有78萬人死于HBV感染相關(guān)并發(fā)癥，可見乙肝已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類健康與生活[1]。研究[2]表明，HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)和HBV DNA定量檢測(cè)是目前普遍接受和公認(rèn)的診斷與判斷HBV感染程度及傳染性的兩種主要方法。血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，能夠快速地獲得結(jié)果，可用于乙肝的大批量篩查，但它不能充分反映HBV復(fù)制情況。HBV DNA定量檢測(cè)可直接、靈活地監(jiān)測(cè)血清中HBV DNA的復(fù)制情況，能清楚地區(qū)別乙肝不同時(shí)期的感染，也可準(zhǔn)確地診斷乙肝的突變株。但是目前利用乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量和HBV DNA定量聯(lián)合檢測(cè)乙肝的相關(guān)研究較少，無法提高HBV感染診斷的準(zhǔn)確率。因此，本研究對(duì)120例乙肝患者的血清學(xué)標(biāo)志物定量和HBV DNA定量聯(lián)合檢測(cè)，探討兩者聯(lián)合在HBV感染中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月-2015年6月在珠海市婦幼保健院住院及門診就診的120例乙肝患者作為研究對(duì)象，男80例，女40例，年齡10～72歲，平均年齡(38.5±4.5)歲。120例患者根據(jù)HBV水平分為三組，Ⅰ組-“大三陽組，即HBsAg、HBeAg、抗HBc陽性，Ⅱ組-“小三陽組，即HBsAg、抗HBe、抗HBc陽性，Ⅲ組-其他模型組，即抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc陽性，抗-HBs、抗-HBc陽性，抗-HBe、抗-HBc陽性，抗-HBc陽性，抗-HBs陽性，HBsAg及全陰性等。3組的性別、年齡等臨床資料相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合國(guó)家衛(wèi)生部(GB15990-1995)制定的乙型病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)者；年齡為10～72歲乙肝患者；無嚴(yán)重心血管疾病或肝部患有腫瘤及囊腫者；近期未接受抗病毒治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有精神疾病或嚴(yán)重的心腦血管疾病者；排除肝部患有惡性腫瘤或囊腫等病癥者；近期接受抗病毒治療者。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 乙型肝炎血清標(biāo)志物ELISA定性試劑盒購于上海博耀生物科技有限公司；HBS-1096A酶標(biāo)分析儀購于南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；IQ5型熒光定量PCR儀購于美國(guó)Bio-Rad公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑及試劑盒購于上海瀘鼎生物科技有限公司。

1.4 方法 所有患者在清晨空腹抽取靜脈血，靜置3 h后，離心分離血清，-20 ℃保存待測(cè)。血清學(xué)標(biāo)志物的定量檢測(cè)：采用人乙肝血清學(xué)標(biāo)志物ELISA定性試劑盒予以檢測(cè)，所有操作及結(jié)果判斷均嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作進(jìn)行。HBV DNA定量檢測(cè)：(1)取100 μl血清加入100 μl DNA濃縮液，充分混勻，離心10 min(12 000 r/min)，棄上清，在管底沉淀中加入20 μl HBV DNA提取液，劇烈振蕩充分混勻，恒溫煮沸10 min，離心8 min(12 000 r/min)，取上清備用；(2)取PCR反應(yīng)管，相應(yīng)地加入處理后的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品各2 μl，離心30 s(5 000 r/min)，放入儀器樣品槽；(3)設(shè)反應(yīng)參數(shù)如下：93 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，40個(gè)循環(huán)；94 ℃→60 ℃退火、延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；(4)儀器讀取熒光值。

1.5 觀察指標(biāo)與診斷標(biāo)準(zhǔn) 觀察HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和HBV DNA水平。血清學(xué)標(biāo)志物定量檢測(cè)的判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：HBsAg濃度≥0.2 ng/ml為陽性，<0.2 ng/ml為陰性。抗-BHs濃度≥10.00 mIU/ml為陽性，<10.00 mIU/ml為陰性。HBeAg濃度≥0.5 PEIU/ml為陽性，<0.5 PEIU/ml為陰性?？?HBe濃度≥0.3 PEIU/ml為陽性，<0.3 PEIU/ml為陰性?？?HBc濃度≥0.9 PEIU/ml為陽性，<0.9 PEIU/ml為陰性。HBV DNA定量檢測(cè)的判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：HBV DNA濃度≥5.0 lg copies/ml為陽性，<5.0 lg copies/ml為陰性。

2 結(jié)果

2.1 HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果 HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果顯示，I組26例，HBV DNA陽性25例，陽性率為96.15%；Ⅱ組52例，HBV DNA陽性25例，陽性率為48.08%；Ⅲ組42例，HBV DNA陽性2例，陽性率為4.76%。與Ⅲ組比較，I組和Ⅱ組的HBV DNA陽性檢出率均明顯升高(P<0.05)；與Ⅱ組比較，I組的HBV DNA陽性檢出率明顯升高(P<0.05)。I組、Ⅱ組和Ⅲ組的HBV DNA定量結(jié)果分別為(7.29±1.40)lg copies/ml、(4.39±1.38)lg copies/ml和(3.60±1.71)lg copies/ml。與Ⅲ組比較，I組和Ⅱ組的HBV DNA定量結(jié)果均明顯升高(P<0.05)；與Ⅱ組比較，Ⅰ組的HBV DNA定量結(jié)果明顯升高(P<0.05)。

2.2 HBV DNA與血清標(biāo)志物陽性率的比較 HBV DNA與血清標(biāo)志物陽性率檢測(cè)結(jié)果如表1所示，在52例HBV DNA陽性標(biāo)本中，HBsAg檢出率為96.15%(50/52)，HBeAg檢出率為46.15%(24/52)，提示HBV DNA陽性患者大多為HBsAg攜帶者。同時(shí)，HBV DNA的檢出符合率為73.33%(88/120)，HBsAg的檢出符合率為72.50%(87/120)，兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 患者HBV DNA和血清標(biāo)志物陽性率對(duì)比Tab 1 Comparison of HBV DNA and serum markers positive rate in patients

2.3 不同血清學(xué)模式的HBV DNA測(cè)定結(jié)果 在不同HBV DNA含量范圍內(nèi)的不同標(biāo)志物模式測(cè)定結(jié)果如表2所示，HBV DNA的含量在2.7～5 lg copies/ml區(qū)間，以“HBsAg、抗HBe、抗HBc陽性”居多，占60.87%(14/23)；在5～7 lg copies/ml區(qū)間，以“HBsAg、HBeAg、抗HBc陽性”居多，占63.63%(7/11)，“HBsAg、抗HBe、抗HBc陽性”占36.36%(4/11)；而在>7 lg copies/ml區(qū)間中，則主要是“HBsAg、HBeAg、抗HBc陽性”模式，占83.33%(15/18)。

表2 不同血清學(xué)模式的HBV DNA測(cè)定結(jié)果[例數(shù)(%)]Tab 2 HBV DNA results of different serological patterns[n(%)]

3 討論

研究[5]認(rèn)為，在HBV感染人體的過程中，機(jī)體的免疫應(yīng)答會(huì)產(chǎn)生免疫殺傷的作用，而免疫功能的強(qiáng)弱則決定HBV感染的程度及病程的歸轉(zhuǎn)。在機(jī)體免疫功能低的情況下，HBV會(huì)持續(xù)復(fù)制，并分泌HBeAg；而在機(jī)體免疫功能高或患者病情好轉(zhuǎn)時(shí)，HBV則會(huì)停止復(fù)制，HBeAg呈陰性，抗-HBe呈陽性。研究[6]表明，乙肝血清學(xué)標(biāo)志物可反映機(jī)體感染HBV時(shí)的免疫狀態(tài)，而HBV DNA則可最直接、可靠地反映乙肝病毒的復(fù)制活動(dòng)，因此，目前認(rèn)為乙肝血清學(xué)標(biāo)志物和分子生物學(xué)檢測(cè)HBV DNA是診斷HBV感染的重要依據(jù)。

乙肝血清學(xué)標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)檢測(cè)多使用ELISA法，它具有快速、價(jià)廉、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，能夠間接反映HBV感染，基本滿足臨床診斷的需要，但不能及時(shí)、動(dòng)態(tài)地反映HBV的復(fù)制情況及其傳染的危險(xiǎn)性。而熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA，可彌補(bǔ)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)的不足[7]。因此，本研究旨在探討乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量和HBV DNA定量聯(lián)合檢測(cè)在HBV感染診斷中的應(yīng)用及其價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，I組HBV DNA定量檢測(cè)陽性率高達(dá)96.15%，顯著高于Ⅱ組(48.08%)及Ⅲ組(4.76%)的陽性檢出率，且HBV DNA水平也明顯高于Ⅱ、Ⅲ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與前人報(bào)道[8-9]的結(jié)果基本一致，提示HBeAg陽性患者體內(nèi)HBV復(fù)制活躍，傳染性較強(qiáng)。在52例HBV DNA陽性病例中，HBsAg檢出率為96.15%，HBeAg檢出率為46.15%，提示HBV DNA陽性患者大多為HBsAg攜帶者，而HBV DNA與HBsAg的檢出符合率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HBeAg值與HBV DNA含量存在一定的關(guān)系。在不同血清學(xué)模式中，HBV DNA含量>7 lg copies/ml時(shí)，I組(大三陽)HBV DNA陽性率，顯著高于其他模式，說明HBV DNA與HBeAg高度相關(guān)，且呈正相關(guān)，一致性較好，即在HBeAg陽性范圍內(nèi)，HBeAg值越高，HBV DNA含量越高，這與楊勇、漆愛紅等[10-11]報(bào)道的結(jié)果一致，提示通過檢測(cè)HBeAg，可間接判斷HBV的復(fù)制及傳染的活躍程度，但并不意味HBeAg轉(zhuǎn)陰HBV就停止復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，HBV DNA含量為5～7 lg copies/ml，Ⅱ組(小三陽)HBV DNA陽性率仍占60.87%，這可能與HBV變異株有關(guān)。

有研究[12]報(bào)道，當(dāng)患者血清HBV DNA水平>5 lg copies/ml時(shí)，HBV復(fù)制較為活躍，而<5 lg copies/ml時(shí)，患者處于低度感染狀態(tài)，因此，在臨床上也應(yīng)同時(shí)進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)，充分了解病毒的復(fù)制情況。有學(xué)者[13]認(rèn)為，使用PCR技術(shù)定量檢測(cè)HBV DNA水平，能用于HBsAg陰性者HBV感染的早期診斷。同時(shí)，PCR方法靈敏度高，可檢出低水平的HBV感染，在無法檢出HBsAg量的情況下，能夠檢出可能因S基因突變?cè)斐蒆BV不再表達(dá)HBsAg而血清學(xué)標(biāo)志物出現(xiàn)全陰患者的HBV感染情況[14]。此外，國(guó)外學(xué)者研究[15]證明，在抗病毒診斷、治療及預(yù)后過程中，HBV DNA定量檢測(cè)可預(yù)測(cè)患者的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，對(duì)隱匿性和外顯性HBV的復(fù)制活躍程度、傳染性、藥物療效等的判斷有重要意義。

綜上所述，血清學(xué)標(biāo)志物定量檢測(cè)可以間接反映HBV的感染情況，但多種血清學(xué)標(biāo)志物為陰性的患者中都出現(xiàn)HBV DNA陽性率，說明HBV DNA定量檢測(cè)HBV的感染能夠很好地補(bǔ)充乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量檢測(cè)的不足。因此，血清學(xué)標(biāo)志物定量和HBV DNA定量聯(lián)合檢測(cè)，能夠提高臨床診斷HBV的準(zhǔn)確率，為臨床判斷HBV感染程度及傳染性提供有效的參考依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：李 健)

The application of combination detection of hepatitis B serological markers quantification and HBV DNA quantification in the diagnosis of hepatitis B virus infection

WU Hongqiu,ZHANG Yongliang,HUANG Jianrao,ZHANG Hanyun

Department of Medical Laboratory Science,Zhuhai Maternal and Child Health Hospital,Zhuhai 519001,China

Objective To analyze the application value of combination detection in the diagnosis of hepatitis B virus (HBV) infection by the quantitative detection of serological markers and HBV DNA of hepatitis B patients.Methods The serum samples of 120 hepatitis B patients from Jun. 2013 to Jun. 2015 were collected,and the ELISA qualitative test and RT-PCR were used to detect the contents of HBV serological markers (HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc) and HBV DNA. Results The HBV DNA positive rate was 96.15% in Ⅰ group; the HBV DNA positive rate was 48.08% in Ⅱ group; the HBV DNA positive rate was 4.76% in Ⅲ group. The quantitative HBV DNA in Ⅰ group was significantly higher than that in Ⅱ and Ⅲ groups (P<0.01); the quantitative HBV DNA in Ⅱ group was significantly higher than that in Ⅲ group (P<0.05). The detection coincidence rates of HBV DNA and HBsAg were 73.33% and 72.50%,respectively,and there was no significant difference between them (P>0.05). Conclusion The combination detection of HBV serological markers and HBV DNA quantification plays a complementary role in the diagnosis of HBV infection,and has a more accurate diagnosis as well as can provide a more effective reference.

Serological markers; HBV DNA; Hepatitis B virus; Quantitative determination

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.014

吳洪秋,主管檢驗(yàn)師,研究方向：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)。E-mail：305370460@qq.com

R512.6+2

A

1006-5709(2016)04-0415-04

2015-08-21