張廷婷，閆彩霞，趙小波，李春娟，石程仁，于久江，單世華*，李榮貴

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；3.Food and Nutrition Biotechnologies,Germantown,Maryland 13314,USA)

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花生根部耐鹽相關(guān)miRNAs的鑒定與功能分析

張廷婷1,2，閆彩霞1，趙小波1，李春娟1，石程仁1，于久江3，單世華1*，李榮貴2*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；3.Food and Nutrition Biotechnologies,Germantown,Maryland 13314,USA)

miRNAs作為一種基因表達調(diào)控子在植物應(yīng)答脅迫的過程中起著重要的作用，當花生受到鹽脅迫時，也會有相應(yīng)的miRNAs參與基因表達調(diào)控應(yīng)答脅迫。本研究對200份花生品種進行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，獲得了高耐鹽花生品種3份，中耐鹽花生品種5份，鹽高敏感品種4份。并對不同耐鹽性花生品種在鹽脅迫處理條件下進行了抗氧化酶活性(SOD，POD，CAT)和MDA含量的測定。結(jié)果表明，耐鹽性花生品種清除活性氧的能力大于鹽敏感型。鹽脅迫條件下，耐鹽性花生植株MDA含量較少，受到的傷害相對較小，而鹽敏感植株的受傷害程度最大，也證明了耐鹽性花生品種在受到鹽脅迫傷害時植物體內(nèi)存在更強大的保護作用。通過小RNA測序及對靶基因序列進行功能分析和同源序列功能檢索，獲得了8條花生耐鹽相關(guān)保守miRNAs序列，miR159-1，miR159-2，miR159-3，miR164-2，miR167-3，miR319-1，miR319-2，miR2111-1。熒光定量PCR測定結(jié)果表明，這些花生保守miRNAs受鹽脅迫誘導(dǎo)，并調(diào)控其靶基因的應(yīng)答反應(yīng)。

花生；miRNA；靶基因；抗氧化酶活性；耐鹽

花生是世界上重要的油料作物之一，也是我國主要的油料作物、經(jīng)濟作物和出口創(chuàng)匯作物。在油料作物中種植面積僅次于油菜，是國民經(jīng)濟發(fā)展的重要保障。中國是世界花生生產(chǎn)大國，種植面積僅次于印度，總產(chǎn)約占世界的40%，居首位，單產(chǎn)高出世界平均水平。即使如此也不能滿足日益增加的需求，特別是入世以來，隨著世界貿(mào)易的進一步擴大，人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的變化，人們對花生及其制品需求量持續(xù)增加，提高花生產(chǎn)量勢在必行。但隨著人口的增加，耕地面積的不斷減少，糧油爭地矛盾日益突出，開發(fā)和利用鹽漬化土地資源是提高花生產(chǎn)量的重要途徑。植物在響應(yīng)及適應(yīng)鹽脅迫的過程中，形成了一系列調(diào)控機制，如滲透調(diào)節(jié)、離子區(qū)域化、高鹽誘導(dǎo)產(chǎn)生大分子蛋白等。其中，脅迫信號的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)是引起植物產(chǎn)生理化響應(yīng)及發(fā)生變化的關(guān)鍵步驟。植物耐鹽能力的大小是一個多基因控制的數(shù)量性狀，涉及生理生化多方面的因素，并由多種耐鹽機制協(xié)調(diào)作用。全生育期耐鹽鑒定發(fā)現(xiàn)花生本身耐鹽能力有限[1]，目前花生耐鹽基因利用方面的研究較少，通過分子生物學(xué)手段研究花生耐鹽機制具有重要的意義。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為21nt左右、內(nèi)源性、非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于植物[2-3]、動物[4-6]和病毒[7-8]中，通過堿基互補對靶mRNA的翻譯進行抑制或降解，參與細胞凋亡、生長控制、脂肪代謝、發(fā)育調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)對脅迫和抗病毒機制等[2,9-11]。miRNAs作為一種基因表達調(diào)控子在植物應(yīng)答脅迫的過程中起著重要的作用。 Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)了123種受各種脅迫誘導(dǎo)的包含miRNA序列的EST疊連群，這些環(huán)境脅迫包括干旱、鹽堿、低溫、高溫、營養(yǎng)缺乏、氧化脅迫以及微生物侵染等。不同的植物，如擬南芥[13]、水稻[14-15]、玉米[16]、毛果楊[17]、大麥[18]以及普通煙草[19]在干旱和鹽堿脅迫下會誘導(dǎo)不同miRNAs的差異表達，這些miRNAs包括miR156、miR159、miR165、miR167、miR168、miR169、miR319、miR393等，如過量表達miR169能增強番茄的抗旱能力。通過生物信息學(xué)和高通量測序的方法，許多保守和新的miRNAs在鹽脅迫的大豆[20]，花生[21-22]，楊樹[19,23]，葡萄[24-25]等植物中被發(fā)現(xiàn)并進行了實驗驗證和功能分析。當花生受到鹽脅迫時，也會有相應(yīng)的miRNAs參與基因表達調(diào)控應(yīng)答脅迫。

目前發(fā)掘植物miRNAs的方法主要有直接克隆法、高通量測序法和生物信息學(xué)法[26]。本研究利用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析及分子生物學(xué)實驗等方法，發(fā)掘和鑒定花生苗期根部耐鹽相關(guān)miRNAs及其靶基因，并研究miRNAs對鹽脅迫的應(yīng)答特性及對靶基因的調(diào)控作用模式，闡明miRNAs的功能。為通過增強或削弱內(nèi)源性miRNAs的基因沉默效應(yīng)來提高花生的耐鹽能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 花生品種篩選與培養(yǎng)

以200份花生種質(zhì)資源為篩選材料，進行萌發(fā)期耐鹽性篩選鑒定試驗。每個品種均采用直徑13cm玻璃培養(yǎng)皿，覆雙層滅菌濾紙，選取飽滿一致的花生種子每皿10粒，處理與對照分別添加100mmol/L NaCl溶液和自來水各30mL，每組設(shè)3個重復(fù)，置于人工氣候室(溫度28℃，濕度60%，光照強度500μmol·m-2·s-1)。培養(yǎng)5d，統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)，胚根長度、株高，計算萌發(fā)率和傷害度。

萌發(fā)率(%)=處理萌發(fā)數(shù)/對照萌發(fā)數(shù)×100

傷害度(%)=(對照平均根長-處理平均根長)/對照平均根長×100

根據(jù)種子萌發(fā)率、傷害度，篩選出不同耐鹽類型(高耐鹽、中耐鹽、鹽敏感)花生品種。本實驗設(shè)定萌發(fā)率大于90%且傷害度低于20%的品種為耐鹽品種，萌發(fā)率大于90%且傷害度低于50%的品種為中耐鹽品種，萌發(fā)率小于70%且傷害度高于20%的品種為鹽敏感品種。

以鑒選出的花生品種A025(耐鹽)、山花10號(中耐鹽)、D001(鹽敏感)為鑒定材料，采用容積4L培養(yǎng)盒加自來水培養(yǎng)于人工氣候室(溫度28℃，濕度60%，光照強度500μmol·m-2·s-1)，每盒30株，種子萌芽培養(yǎng)20d后，于200mmol/L NaCl溶液分別處理0、2、4、6、8h后取根，液氮冷凍后保存于-80℃冰箱備用。每組設(shè)3次重復(fù)。

1.2 測序與生物信息學(xué)分析

構(gòu)建花生Small RNA文庫，利用雙末端測序(Paired-End)法，完成花生Small RNA(對照組和處理組2、4、6、8h混合根樣品)測序，并進行生物信息分析。通過WebGO和InterPro分析，對靶基因序列進行功能分析和同源序列功能檢索，獲得了花生耐鹽相關(guān)保守miRNAs序列，選擇8條miRNA及其靶基因序列作為研究對象，以花生品種山花10號為材料，對鹽脅迫下花生根部耐鹽相關(guān)miRNAs及其靶基因的表達量進行測定。

1.3 RNA及miRNA的提取

花生樣品RNA的提取參照寶生物GeneJET Plant RNA提取試劑盒說明書進行。miRNA的提取參照天根miRcute miRNA提取試劑盒說明書進行。提取樣品采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000分光光度計檢測純度和濃度。

1.4 抗氧化酶活性的測定

稱取花生根樣品(0.5g)，按重量(g)：體積(mL)=1∶9 (SOD的測定按照1∶4)的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L pH7～7.4)，冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿，3500r/min離心10min后，取上清液。參照南京建成生物工程研究所的POD、SOD、CAT、MDA試劑盒方法進行測定并計算。

1.5 熒光定量PCR分析

Actin基因作為內(nèi)參基因，引物5'-GAG GAG AAG CAG AAG CAA GTT G；5'-AGA CAG CAT ATC GGC ACT CAT C。miRNAs序列及引物設(shè)計如表1：

qRT-PCR 分析參照TaKaRa SYBR?PrimixEx TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，采用ABI 7300/7500和StepOnePlusTM Real-Time PCR System進行。PCR反應(yīng)液的組份配制如表2所示(反應(yīng)液配制在冰上進行)。

表1 miRNAs序列及引物設(shè)計Table 1 miRNA sequence and primer design

表2 PCR反應(yīng)液的配制組份Table 2 Component of PCR reaction solution

反應(yīng)條件：第一步預(yù)變性：95℃ 2min，第二步熒光收集：94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 20s共40個循環(huán)，第三步溶解曲線分析：65℃逐步升溫到95℃間隔0.1℃收集一次熒光信號，第四步冷卻：40℃冷卻30s。每管重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽花生品種篩選

以200份花生種質(zhì)資源為篩選材料，進行萌發(fā)期耐鹽性篩選鑒定試驗，獲得高耐鹽花生品種3份，中耐鹽花生品種5份，鹽高敏感品種4份。表3為部分典型品種耐鹽類型。

表3 耐鹽篩選部分典型品種Table 3 Typical varieties of salt tolerance in screening

2.2 鹽脅迫對不同花生品種根部抗氧化酶活性的影響

200mmol/L NaCl鹽脅迫處理前與處理后，耐鹽性高的花生品種抗氧化酶活性(SOD，POD，CAT)都明顯高于鹽敏感品種(圖1)。鹽脅迫處理不同時間，不同花生品種根的超氧化物歧化酶(SOD)活性都有不同的變化，耐鹽性品種A025呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，中耐鹽品種山花10號和鹽敏感品種D001呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1A)。鹽處理2h時，不同花生品種根的POD活性都出現(xiàn)明顯的下降，但隨著鹽處理時間的延長至4h，6h，8h，POD活性都維持在一定水平變化不明顯(圖1B)。鹽處理2h內(nèi)，各品種的CAT活性沒有明顯變化，2h之后，A025開始升高，山花10號和D001開始下降，6h時都達到最高或最低并維持在一定水平不再變化(圖1C)。表明耐鹽花生品種植株的清除活性氧的能力大于鹽敏感型，相同的鹽處理時間，不同耐鹽類型的抗氧化酶活性變化不一致，清除活性氧的能力受到不同程度的影響。

2.3 鹽脅迫對不同花生品種根部丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，它能抑制細胞保護酶的活性和降低抗氧化物的含量，從而加劇膜脂過氧化作用，其值大小可以反映根受到逆境傷害的程度。 在受到逆境傷害時，丙二醛的含量與細胞膜的傷害程度正相關(guān)。圖2所示，在200mmol/L NaCl處理后，不同耐鹽類型花生品種根的丙二醛含量都增加，然而鹽敏感型品種D001丙二醛含量增加得多，耐鹽品種A025增加較少，說明耐鹽性花生根部細胞膜系統(tǒng)受到的損害相對較小，而鹽敏感花生根部細胞膜系統(tǒng)受到的損害程度最大，也證明了耐鹽性花生品種在受到鹽脅迫傷害時植物體內(nèi)存在更強大的保護作用。

圖1 200mmol/L NaCl處理對不同耐鹽性花生品種SOD,POD和CAT活性的影響Fig.1 The effects of 200mmol/L NaCl treatment on the activities of SOD,POD and CAT in roots of peanut plants注：圖中數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±S.E.。圖2同此。Note:Values are means ± SD (n = 3) from one representative of three independent experiments.The same as in fig.2.

圖2 200mmol/L NaCl處理對不同耐鹽性花生品種丙二醛(MDA)含量的影響Fig.2 The effects of 200mmol/L NaCl treatment on the content of MDA in roots of peanut plants

2.4 鹽脅迫對花生根部miRNA的影響

在200mmol/L NaCl脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，miR159-1，miR159-2，miR159-3，miR164-2，miR167-3，miR319-1，miR319-2，miR2111-1及其靶基因的表達量都發(fā)生了不同的變化。如圖3所示，在200mmol/L NaCl脅迫處理條件下，miR159-1，miR159-3，miR167-3，miR319-1，miR319-2表現(xiàn)為上調(diào)表達，其靶基因表達下調(diào)，miR159-2，miR164-2表現(xiàn)為表達下調(diào)，其靶基因表達上調(diào)。

在脅迫處理2h，6h，8h時，miRNA159-1表達量增加比較多，而在4h時，miRNA和靶基因檢測表達無明顯變化。miRNA159-2及其靶基因的表達受鹽脅迫4h和8h時影響較大。在脅迫處理6h，8h時，miRNA159-3表達量增加比較多，耐鹽作用更強。miR164-2靶基因1表達沒有明顯受到調(diào)控，靶基因2表達明顯上調(diào)，但在6h，8h時，miR164-2表達下調(diào)較小，而靶基因2表達量卻增加比較多，說明靶基因1 miR164-2調(diào)控影響不大，靶基因2明顯受miR164-2的調(diào)控，但也會受到其他miRNA的調(diào)控，miRNA與靶基因的關(guān)系是一對多、多對多的調(diào)控關(guān)系。脅迫處理8h時，明顯誘導(dǎo)了miR167-3的耐鹽作用機制，表現(xiàn)出更強的調(diào)控作用。miR319-1的總體表達是上調(diào)的，其靶基因表達先下調(diào)后上調(diào)，二者也無明顯規(guī)律，推測miR319-1與耐鹽脅迫有一定相關(guān)性，miR319-1與其靶基因的關(guān)系也不是一對一的調(diào)控關(guān)系。miR319-2的表達受鹽脅迫誘導(dǎo)，2h時最為敏感，在短暫的時間內(nèi)就啟動了耐鹽調(diào)控機制。

圖3 山花10號在200mmol/L NaCl處理下，根部miR159-1，miR159-2，miR159-3，miR164-2，miR167-3，miR319-1，miR319-2，miR2111-1及其靶基因的相對表達量分析Fig.3 Relative expression levels of miR159-1，miR159-2，miR159-3，miR164-2，miR167-3，miR319-1，miR319-2，miR2111-1 and their target genes in peanut Shanhua10 under 200mmol/L NaCl treatment

miR2111-1表達先下調(diào)后上調(diào)，其靶基因表達也出現(xiàn)相似規(guī)律，可見靶基因受miRNA的調(diào)控不對應(yīng)。鹽脅迫處理6h以內(nèi)，miR2111-1表達下調(diào)，而在8h時，表達明顯增加，靶基因表達明顯降低，可能是6h以內(nèi)，miR2111-1及其靶基因的表達不只是受到鹽脅迫誘導(dǎo)，而在8h以后，才明顯受到鹽脅迫誘導(dǎo)，啟動了耐鹽調(diào)控機制。也可能miR2111-1在花生受到鹽脅迫時，并沒有明顯的關(guān)系，具體有待進一步研究確認。后續(xù)的研究中，需要研究脅迫8h以后的表達情況，完善數(shù)據(jù)。

3 討論與結(jié)論

本研究對200份花生品種進行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，獲得了高耐鹽花生品種3份，中耐鹽花生品種5份，鹽高敏感品種4份。并對不同耐鹽性花生品種在鹽脅迫處理條件下進行了抗氧化酶活性(SOD，POD，CAT)和MDA含量的測定，結(jié)果表明耐鹽花生品種植株的清除活性氧的能力大于鹽敏感型。鹽脅迫條件下，耐鹽性花生根部MDA含量較少，細胞膜系統(tǒng)受到的損害相對較小，而鹽敏感植株膜損害程度最大，也證明了耐鹽性花生品種在受到鹽脅迫傷害時植物體內(nèi)存在更強大的保護機制。

通過對靶基因序列進行功能分析和同源序列功能檢索，獲得了miR159-1，miR159-2，miR159-3，miR164-2，miR167-3，miR319-1，miR319-2，miR2111-1 八條花生耐鹽相關(guān)保守miRNAs。以花生品種山花10號為材料，在200mmol/L NaCl脅迫條件下，隨脅迫時間延長，花生根部耐鹽相關(guān)miRNAs及其靶基因的表達量都發(fā)生了不同的變化，也進一步證明了這些花生保守miRNAs在鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用特點。與前人研究結(jié)果基本一致[13-19]。

鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPKs)是miR167的靶基因之一[27-28]。植物感受到正常生長發(fā)育信號和應(yīng)答外部的逆境脅迫信號后，導(dǎo)致植物細胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度發(fā)生改變，經(jīng)過特殊的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將鈣信號逐級放大，并向下游繼續(xù)傳遞，使植物表現(xiàn)出不同的生理生化反應(yīng)?；ㄉ邴}堿地不能正常生長的較大影響因素就是Ca2+作用失調(diào)，深入研究miR167的作用機制將為提高花生耐鹽種質(zhì)創(chuàng)新提供重要的思路和途徑。

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Identification and Functional Characterization of Salt Tolerance Related microRNAs in Roots of Peanut (ArachishypogaeaL.)

ZHANG Ting-ting1,2,YAN Cai-xia1,ZHAO Xiao-bo1,LI Chun-juan1, SHI Cheng-ren1,YU Jiu-jiang3,SHAN Shi-hua1*,LI Rong-gui2*

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China; 2.CollegeofLifeScience,QingdaoUniv.,Qingdao266071,China; 3.FoodandNutritionBiotechnologies,Germantown,Maryland13314,USA)

miRNAs as a gene expression regulator plays an important role in the process of plant response to stress.When peanut suffered from salt stress,there will be the corresponding miRNAs involved in the regulation of gene expression responding to stresses.3 salt-tolerant,5 moderate salt-tolerant and 4 high salt-sensitive peanut varieties were screened out from 200 peanut germplasm resources in germination and seedling stage.The results of antioxidase activities and malondialdehyde content indicated that the salt-tolerant plant had stronger ability to eliminate reactive oxygen species.And the salt-tolerant plants suffered less from salt treatment than the salt-sensitive ones,which also showed the self protective response.Through miRNA sequencing and Gene Ontology (GO) functional annotation of target gene sequences,eight salt tolerance related miRNA sequences (miR159-1,miR159-2,miR159-3,miR164-2,miR167-3,miR319-1,miR319-2,miR2111-1) were obtained.qRT-PCR analyses demonstrated that these peanut miRNAs are regulated by salt stress,resulting in appropriate biological responses of their target genes.

peanut; microRNA; target gene; antioxidase activities; salt-tolerance

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.04.007

2016-10-27

國家國際科技合作專項項目(2015DFA31190)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項目(2015YQN07)；山東省花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(SDAIT-04-02)；山東省良種工程項目；青島市博士后基金項目(2015142)

張廷婷(1981-)，女，山東泰安人，山東省花生研究所助理研究員，博士后，主要從事花生抗逆相關(guān)miRNAs功能分析研究。

*通訊作者：單世華(1971-)，研究員，主要從事花生遺傳育種與種質(zhì)資源研究。E-mail:shhshan@sina.com

S565.2034; Q756

A

李榮貴(1969-)，教授，主要從事松萎蔫病分子機制研究。E-mail:lrg@qdu.edu.cn