雞球蟲(chóng)DNA疫苗在生產(chǎn)推廣過(guò)程中的安全性評(píng)價(jià)

楊錦昌 周曉波

（鹽城市畜牧獸醫(yī)站，江蘇鹽城 224002）

雞球蟲(chóng)DNA疫苗在生產(chǎn)推廣過(guò)程中的安全性評(píng)價(jià)

楊錦昌 周曉波

（鹽城市畜牧獸醫(yī)站，江蘇鹽城 224002）

雞球蟲(chóng)病是雞常見(jiàn)的一種急性流行性原蟲(chóng)病。以消瘦、貧血、血痢、生長(zhǎng)發(fā)育受阻為特征；病原為艾美耳屬的7種球蟲(chóng)，其中危害最大的有兩種：柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和毒害艾美耳球蟲(chóng)，前者寄生于盲腸中，后者寄生于小腸粘膜中，臨床上往往表現(xiàn)為多種球蟲(chóng)混合感染。本病以濕熱多雨的夏季多發(fā)，主要發(fā)生于3個(gè)月以?xún)?nèi)的幼雞，其中以2～7周齡雞最易感，10日齡以?xún)?nèi)雛雞少發(fā)，成年雞感染則不表現(xiàn)癥狀；1月齡左右雞多患盲腸球蟲(chóng)，2月齡以上雞多患小腸球蟲(chóng)。一旦發(fā)病，重則引起大面積的死亡，輕則導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受陰，影響其正常生產(chǎn)性能。目前生產(chǎn)實(shí)踐中多采用在飼料中添加抗球蟲(chóng)藥物預(yù)防和治療，由于藥物的長(zhǎng)期使用，逐漸產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致防控效果越來(lái)越差。如何找到一種更好的預(yù)防辦法是當(dāng)務(wù)之急，使用疫苗防疫可以起到事半功倍的效果。

雞球蟲(chóng)DNA疫苗；檢測(cè)；質(zhì)粒DNA

雞球蟲(chóng)DNA疫苗是免疫效果較好的基因疫苗之一。這些疫苗大部分在實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)可以提供對(duì)球蟲(chóng)卵囊的免疫保護(hù)力，但對(duì)其安全性的認(rèn)識(shí)只停留在理論分析階段，缺乏對(duì)雞球蟲(chóng)DNA疫苗的生物安全性評(píng)價(jià)，致其還不能用于生產(chǎn)實(shí)際。為了充分評(píng)價(jià)DNA疫苗的生物安全性，我們選取四種有代表性的球蟲(chóng)疫苗，分別為pVAX1.0-TA4-IL-2，pVAX1.0-NA4-IL-2，pVAX1.0-EM8-IL-2，pVAX1.0-LDH-IL-2進(jìn)行試驗(yàn)。旨在為該疫苗應(yīng)用的可行性提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器的準(zhǔn)備

質(zhì)粒，主要試劑及儀器的準(zhǔn)備，所需溶液及其配置。

1.2 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化及制備

用大腸桿菌DH5α制備感受態(tài)細(xì)胞，按分子常規(guī)克隆方法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化。裂解法制備大量質(zhì)粒，PEG沉淀法進(jìn)行純化。

1.3 質(zhì)粒的定量定性及鑒定

分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的含量，雙酶酶切質(zhì)粒，跑電泳進(jìn)行鑒定。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物的分組和免疫

選擇1日齡小公雛，將制備的四種DNA疫苗混合，通過(guò)腿部肌肉分別注射給不同組別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)每組設(shè)置PBS注射的空白對(duì)照。分組如下：

組別 雞日齡（d） 數(shù)量（只） 接種方式 劑量（μg/只） 接種次數(shù)（次） 間隔天數(shù)（d） 疫苗批次1 1 120 肌肉注射 25 1 0 同一批2 120 肌肉注射 25 3 7 同一批3 14 240 肌肉注射 75 1 0 3個(gè)批次7

1.5 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和序列，分別設(shè)置四對(duì)特異性引物。

1.6 受試動(dòng)物臨床反應(yīng)的觀察

每天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲水、進(jìn)食、糞便、活動(dòng)及死亡情況等，并進(jìn)行詳細(xì)的記錄。

1.7 質(zhì)粒在組織中的分布和存留時(shí)間

免疫后每2～4周隨機(jī)處死5只雞，分別采取血液、心、肝、脾、腎臟、注射部位肌肉，RT-PCR檢測(cè)。

1.8 病理學(xué)變化檢測(cè)

處死試驗(yàn)雞的同時(shí)多點(diǎn)采取心、肝、脾、腎、腸及腿部注射部位肌肉，按常規(guī)方法制備石蠟切片，蘇木精——伊紅（H.E）染色方法進(jìn)行染色并鏡檢分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)疫苗的臨床反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫前后精神狀態(tài)良好；采食量、飲水沒(méi)有明顯變化；糞便情況良好；活動(dòng)情況正常；沒(méi)有發(fā)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物突然死亡的情況；說(shuō)明受試動(dòng)物對(duì)該疫苗無(wú)不良生理反應(yīng)。

2.2 質(zhì)粒在注射部位及主要臟器的分布和存留

（1）實(shí)驗(yàn)組1組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：

?

M：.MarkerDL2000，1.陽(yáng)性對(duì)照，2.陰性對(duì)照，3.心，4.肝，5.脾，6.腎，7.注射部位，8.血液A：免疫后1個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果 B：免疫后1.5個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果C：免疫后2個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果D：免疫后3個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果E：免疫后4個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果

（2）實(shí)驗(yàn)組2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：

及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合EM8 心、肝、脾、腎NA4 心、肝、脾、腎檢測(cè)基因 檢出部位 變化趨勢(shì) 最晚檢出時(shí)間 結(jié)論TA4 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合NA4 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合EM8 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合LDH 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合LDH 心、肝、脾、腎

（3）實(shí)驗(yàn)組3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果：注射疫苗后，前兩個(gè)月三個(gè)批次的疫苗均在注射部位組織、心、肝、脾和腎中能擴(kuò)增出特異性DNA片段，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，疫苗DNA在體內(nèi)存在的量越來(lái)越少，到2至4月齡，在所有組織中幾乎檢測(cè)不到特異性DNA，說(shuō)明質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合。

2.3 臟器組織病理學(xué)變化

（1）免疫后1個(gè)月，組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

免疫后免1個(gè)疫后月1主個(gè)要月組主織要組圖織片圖（片4（0040×0×））A.心 B.肝A. 心C.B脾.肝 CD..脾腎D .腎E.E肌.肌肉肉 FF..十十二二腸腸

2）免疫后1.5個(gè)月，組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

免疫后1.5個(gè)月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

（3）免疫后2個(gè)月，組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

免疫后2個(gè)月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

（4）免疫后3個(gè)月，組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

免疫后3個(gè)月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

（5）免疫后4個(gè)月，組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

免疫后4個(gè)月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

3 討論

DNA疫苗是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗，由于它既具有亞單位苗和滅活苗的安全性，又兼?zhèn)渲挥卸久缁蛑亟M疫苗才具有的誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。DNA疫苗很可能給免疫預(yù)防治療領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)根本性的變革。然而，在大范圍的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)之前，還有許多急需解決的問(wèn)題。而首先應(yīng)考慮的問(wèn)題就是DNA 疫苗的安全性問(wèn)題。主要是確定其是否被整合到宿主基因組 DNA中。本試驗(yàn)室選擇美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）認(rèn)可的安全性較高的pVAX1.0作為球蟲(chóng)DNA疫苗的表達(dá)載體。

本試驗(yàn)通過(guò)PCR檢測(cè)了四種DNA疫苗在注射部位的存留以及在主要臟器的分布和存留。經(jīng)，疫苗在免疫后的1～2個(gè)月在血液，心臟，肝臟，脾臟，腎臟和疫苗注射部位的肌肉都能檢測(cè)到。說(shuō)明免疫后質(zhì)?？赡軙?huì)隨血液分布到各組織，并在組織中停留一段時(shí)間。隨著時(shí)間的推移，在免疫后的3個(gè)月之后就一直檢測(cè)不出質(zhì)粒的存在。說(shuō)明質(zhì)粒在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的代謝，可以被宿主清除。并且四種質(zhì)粒DNA的代謝速度較為一致，僅有個(gè)別組在免疫后的2個(gè)月就檢測(cè)不到質(zhì)粒，分析原因應(yīng)為由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活環(huán)境差異導(dǎo)致的，并不影響本實(shí)驗(yàn)對(duì)四種疫苗的安全性評(píng)價(jià)。

基因疫苗致使組織產(chǎn)生病理學(xué)損害的可能原因有三，一是因質(zhì)粒純度不夠，宿主菌殘留成分導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)或毒性反應(yīng)；二是質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物可能具有某種程度的毒性或刺激機(jī)體產(chǎn)生超敏反應(yīng)；三是質(zhì)粒序列可能與受試動(dòng)物基因組發(fā)生整合，整合后可能導(dǎo)致原癌基因的表達(dá)或抑癌基因失活，使被整合細(xì)胞發(fā)生惡性變。本試驗(yàn)所應(yīng)用的質(zhì)粒DNA本身沒(méi)有任何毒副作用，也不刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在組織中以附加體的形式存在，并隨著細(xì)胞的代謝逐漸消失，不應(yīng)引起炎性反應(yīng)，并且質(zhì)粒DNA為純化制品，細(xì)菌蛋白成分已經(jīng)被最大限度的抽提去除，DNA樣品在紫外分光定量時(shí)，純度在95%以上，蛋白質(zhì)達(dá)到“檢不出”的水平，可以認(rèn)為不存在宿主菌蛋白成分，同時(shí)溶解質(zhì)粒的介質(zhì)是0.01M pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，該介質(zhì)自身無(wú)任何毒副作用，也不會(huì)“誘導(dǎo)”質(zhì)粒DNA產(chǎn)生任何毒副作用。因此，雖然質(zhì)粒DNA分布到了心臟，肝臟，脾臟，腎臟和肌肉，但無(wú)可見(jiàn)的組織病理學(xué)變化。質(zhì)粒DNA與受試動(dòng)物染色體整合的可能性及激活原癌基因或滅活抑癌基因的可能性均很小或無(wú)。因此，從理論上來(lái)看，不可能導(dǎo)致機(jī)體臟器產(chǎn)生組織病理學(xué)變化。本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步印證了這一點(diǎn)。

本試驗(yàn)在進(jìn)行生物安全性評(píng)定的同時(shí)，還對(duì)該疫苗的免疫程序進(jìn)行了初步探索。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重復(fù)接種后質(zhì)粒在機(jī)體組織中的存留與一次接種后質(zhì)粒在組織中的存留無(wú)太大差別，有關(guān)基因免疫是否需要加強(qiáng)免疫說(shuō)法不一。有報(bào)道認(rèn)為，DNA疫苗免疫大動(dòng)物一次后即可誘發(fā)較好的體液免疫，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；但也有報(bào)道認(rèn)為，須經(jīng)加強(qiáng)免疫后方可達(dá)到較高水平。本試驗(yàn)重復(fù)接種組與其他組并沒(méi)有太大差別，引起這種結(jié)果的原因可能有多種：第一，DNA免疫后肌細(xì)胞和如何受納質(zhì)粒DNA，受納率和受納量是多少還不是很清楚，不同的雞只間可能有差異；第二，不同的受試動(dòng)物所受納的含有完整表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA的量不同，從而導(dǎo)致表達(dá)的蛋白量不同，表達(dá)量低，相對(duì)來(lái)說(shuō)免疫反應(yīng)就比較弱；第三，不同機(jī)體對(duì)所表達(dá)外源蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)弱不同。因此在保證安全性的前提下，要探索一種免疫程序延長(zhǎng)質(zhì)粒在組織中的存留時(shí)間，使得延長(zhǎng)在體內(nèi)的免疫保護(hù)效果。

本試驗(yàn)也對(duì)超劑量接種的情況作了研究，研究表明質(zhì)粒在三個(gè)月的時(shí)候已經(jīng)檢測(cè)不到，在組織中也沒(méi)檢測(cè)到病理變化，因此，超劑量接種對(duì)雞體是安全的。

目前國(guó)外有關(guān)DNA疫苗安全性報(bào)道的研究不多，就從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，實(shí)驗(yàn)中的四種球蟲(chóng)DNA疫苗對(duì)雞體都是相對(duì)安全的。

[1]黃金貴，李運(yùn)娜，張西臣.雞球蟲(chóng)病疫苗的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，（8）：983-987.

[2]張擇揚(yáng). 四種雞球蟲(chóng)DNA疫苗在機(jī)體組織中的分布和在環(huán)境中的釋放[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.