產(chǎn)綠原酸內(nèi)生菌細胞色素P450基因的克隆和功能研究

王川李麗魏丕偉黃非

（1. 四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，自貢 643000；2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064）

產(chǎn)綠原酸內(nèi)生菌細胞色素P450基因的克隆和功能研究

王川1李麗1魏丕偉1黃非2

（1. 四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，自貢 643000；2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064）

以一株產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌為基礎(chǔ)，對其綠原酸途徑的關(guān)鍵酶基因進行克隆和功能研究?？寺≡搩?nèi)生菌的細胞色素P450基因并進行原核表達，對重組蛋白進行肉桂酸羥基化酶（C4H）酶活測定。結(jié)果顯示，從內(nèi)生菌中克隆了4個細胞色素P450酶系基因并進行了原核表達，其中P-4重組蛋白具有C4H活性，產(chǎn)生的香豆酸與LC-MS檢測的結(jié)果一致，該酶的最適溫度范圍較寬，產(chǎn)物香豆酸對該酶有抑制作用。該內(nèi)生菌可能利用其細胞色素P450酶系作為C4H的同工酶從而將產(chǎn)物導(dǎo)入綠原酸合成途徑。

綠原酸；細胞色素P450；C4H；表達；活性

內(nèi)生菌是一種幾乎存在于所有植物，且不引起植物外在病害癥狀的微生物。已有的研究表明，一些藥用植物中的內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分［1］，因此內(nèi)生菌可能具有與植物大致相同的代謝途徑和相應(yīng)的酶類，這就使內(nèi)生菌成為了開發(fā)藥用植物功能基因的新資源。綠原酸是多種藥用植物中的活性成分，在綠原酸合成途徑中，有兩步羥基化反應(yīng)，分別是肉桂酸羥基化生成對香豆酸和香豆?？崴崃u基化生成綠原酸，由肉桂酰羥基化酶（C4H）和香豆酰3'-羥基化酶（C3'H）催化，這兩種酶均屬于植物細胞色素P450體系，是合成綠原酸途徑的限速酶［2］。細胞色素P450廣泛存在于動植物及細菌、真菌中，P450催化的反應(yīng)廣泛而復(fù)雜，包括羥化、環(huán)氧化、去烷基化、磺化等氧化反應(yīng)和異構(gòu)化、脫水等還原反應(yīng)，在植物的次生代謝物的合成方面有非常重要的功能［3-5］。

目前對植物P450的研究較多，而對原核生物P450的研究還處在起步階段，報道較少，本研究以一株分離自金銀花的產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌為基礎(chǔ)，從該內(nèi)生菌中克隆出細胞色素P450的幾種同工酶基因，并進行基因的表達和功能研究，旨在了解該內(nèi)生菌的綠原酸代謝途徑特點，為該內(nèi)生菌的進一步利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 內(nèi)生枯草芽孢桿菌RP1（GenBank 登錄號：KF053071）由本實驗室分離并保存，大腸桿菌BL21（DE3）、pET28a質(zhì)粒、E. coli JM109 化學(xué)感受態(tài)細胞。

1.1.2 試劑 膠回收試劑盒，Omega；內(nèi)切酶Nhe I、Sac I，T4連接酶，F(xiàn)ermentas；pMD19-T vector，EX Taq 及PCR試劑，TaKaRa；IPTG，Amresco；Taq酶及試劑、BCA蛋白定量試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，Tiangen；Ni-His親和層析柱，Merk；引物由上海英濰捷基公司（invitrogen）合成。

TEGN緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），5 mmol/L EDTA（pH8.0），5% 甘油，50 mmol/LNaCl。Binding buffer：0.5 mol/L NaCl，200 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L 咪唑 pH 7.9。Wash buffer：0.5 mol/L NaCl，200 mmol/L Tris-HCl，60 mmol/L 咪唑 pH 7.9。Elute buffer：0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1mol/L咪唑 pH7.9。

1.1.3 儀器 PCR儀，電泳儀（Biorad）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌P450基因的克隆 內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌RP1基因組DNA提取采用DNA提取試劑盒提取。由于在枯草芽孢桿菌中沒有C3'H和C4H的同名或同源基因的報道，因此通過比對幾種植物中C3'H和C4H的活性中心保守片段，確定了枯草芽孢桿菌的4個功能近似的單氧化酶基因，在此基礎(chǔ)上設(shè)計引物如表1。

PCR反應(yīng)條件如下：94℃ 變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，5 個循環(huán)；94℃ 30 s，53℃ 30 s， 72℃ 2 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃2 min，20個循環(huán)；72℃ 10 min；16℃保溫。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后以膠回收試劑盒回收。回收片段連接pMD19-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109 感受態(tài)細胞，以菌落PCR篩選，陽性子送上海華津生物公司測序。

表1 引物序列

1.2.2 P450基因原核表達載體的構(gòu)建 測序正確的陽性子以質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒與載體pET28a分別以Nhe I和Sac I雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物以T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細胞，以菌落PCR篩選陽性子并進行雙酶切驗證，構(gòu)建4個P450-pET28a原核表達載體。

1.2.3 P450基因的表達和純化 提取陽性子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）細胞，轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600≈ 0.4-0.6，以250 μmol/L IPTG 誘導(dǎo)并在18℃培養(yǎng)12 h，菌液經(jīng)TEGN緩沖液重懸后以溶菌酶破碎30 min，取上清進行SDS- PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。重組蛋白以鎳親和層析柱進行純化，依次以Binding buffer，Wash buffer和Elute buffer洗脫，純化蛋白經(jīng)SDSPAGE檢測后以20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）加5%甘油透析過夜，以BCA蛋白定量試劑盒測定含量。

1.2.4 P450重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì) 對純化的4個P450重組蛋白進行C4H活性測定，C4H活性測定按文獻［4］進行略有改動，測定肉桂酸羥基化后NAPDH在340 nm下的吸光值變化，2 mL反應(yīng)體系如下：50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 μmol/L肉桂酸，20 μmol/L NADPH，5 μL純化蛋白，以10 μL水為空白對照，加入酶后立即測定OD340值，30℃反應(yīng)30 min后測定OD340值。將在該測定條件下每分鐘催化反應(yīng)消耗1 μmol NADPH所需要的酶量定義為1個酶活性單位。

米氏常數(shù)的確定：設(shè)置不同肉桂酸濃度（2、5、10、20、25、35和50 μmol/L）下反應(yīng)測定OD340變化，以雙倒數(shù)作圖法確定酶促反應(yīng)的Km值和Vmax。

酶促反應(yīng)的影響因素：上述反應(yīng)體系分別置于不同溫度、不同pH，以及加入不同體積的純化蛋白或不同濃度的香豆酸，測定相應(yīng)酶活力，確定酶促反應(yīng)的最適溫度、最適pH，以及酶濃度和產(chǎn)物濃度對酶促反應(yīng)的影響。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生菌RP1的P450基因的克隆

從內(nèi)生枯草芽孢桿菌RP1中提取基因組，以該基因組DAN為模板，以引物1，2，3，4通過PCR擴增獲得了內(nèi)生枯草芽孢桿菌RP1的4個相應(yīng)的目標基因（圖1），分別為P-1，P-2，P-3和P-4。測序結(jié)果表明4個目標基因大小分別為1 294 bp（P-1），1 109 bp（P-2），1 217 bp（P-3）和1 190 bp（P-4），符合預(yù)期片段大小。GenBank比對結(jié)果顯示，4個目標基因均屬于細胞色素P450家族。其中P-1與Bacillus subtilis的細胞色素P450（Cytochrome P450）有99%相似性。P-2基因與Bacillus subtilis的細胞色素P450 YjiB（Cytochrome P450 YjiB）有99%相似性。P-3基因與Bacillus subtilis的細胞色素單氧化酶（monooxygenase）有99%相似性，P-4基因Bacillus subtilis的 細 胞 色 素P450 YjiB（Cytochrome P450 YjiB）有98%相似性，這表明目標基因克隆成功，以上4個基因的GenBank登錄號分別為KC561925，KC561926，KC561927，KC561928。

2.2 內(nèi)生菌P450同工酶基因的原核表達和純化

將各P450同工基因片段和表達載體pET28a構(gòu)建成重組表達載體，經(jīng)NheⅠ和SacⅠ雙酶切驗證，得到分別與載體pET28a和各基因片段大小相符的兩條帶（圖2），表明各P450同工基因的重組表達載體構(gòu)造成功。

圖1 內(nèi)生菌細胞色素P450基因克隆

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-P450酶切鑒定

將連接成功的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，以SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖3）顯示，在誘導(dǎo)條件下，4個P450同工基因的表達載體均獲得了符合預(yù)期分子量大小的重組蛋白，而對應(yīng)的非誘導(dǎo)條件和pET28a/BL21空白裂解液，均未出現(xiàn)目的重組蛋白，這表明重組蛋白表達成功，4種P450同工酶蛋白均可進行可溶性表達。進一步對4種同工蛋白進行鎳親和層析純化，結(jié)果（圖4）顯示純化成功，對4種重組蛋白經(jīng)BCA蛋白定量分別為 342 μg/mL（P-1）、403 μg/mL（P-2），331 μg/mL（P-3），375 μg/mL（P-4），純化的蛋白用于酶活測定。

2.3 P450重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)

對4種P450重組蛋白的酶活性測定結(jié)果表明，反應(yīng)體系中加入P-1、P-2和P-3三種重組蛋白后的OD340沒有變化，因而沒有C4H活性。而P-4重組蛋白顯示出了C4H活性，其Km值和Vmax分別為5.6 μmol/L和2.08 μmol/min，為米氏酶。P-4重組蛋白酶的最適合溫度的范圍比較廣，在25-40℃之間（圖5），最適pH為7.5，耐受酸堿的能力較弱（圖6）。酶促反應(yīng)隨酶濃度先增加后降低，在酶濃度達到一定程度后，反應(yīng)速度趨于穩(wěn)定（圖7）。反應(yīng)產(chǎn)物對香豆酸對酶促反應(yīng)有反饋抑制作用，在對香豆酸低濃度時抑制作用較弱，產(chǎn)物達到一定濃度（100 μmol/L）能大大降低酶活力（圖8）。P-4蛋白序列經(jīng)比對為屬于枯草芽孢桿菌細胞色素P450家族，與枯草芽孢桿菌的P450YjiB有98%相似性，以上活性測定結(jié)果表明內(nèi)生枯草芽孢桿菌RP1可能通過屬于P450酶系的P-4蛋白的C4H活性進行綠原酸合成途徑的肉桂酸羥基化反應(yīng)，P-4基因可能是植物的C4H基因的同工酶基因。

圖3 四種重組蛋白不同條件的表達

圖4 重組蛋白P450的純化

3 討論

圖5 重組蛋白P-4的最適溫度

圖6 重組蛋白P-4的最適pH

圖7 酶濃度對重組蛋白P-4活性的影響

在植物中，綠原酸主要由苯丙氨酸通過苯丙烷途徑產(chǎn)生，其中苯丙烷途徑的兩步羥基化反應(yīng)分別由屬于植物細胞色素P450體系的肉桂酰羥基化酶（C4H）和香豆酰3'-羥基化酶（C3'H）催化，這兩種酶具有功能上的相關(guān)性，是苯丙烷途徑合成綠原酸的限速酶，目前對細胞色素P450的研究多集中在對植物來源的P450的克隆和表達，而對細菌來源的P450的研究較為缺乏。本研究以一株分離自金銀花的產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌RP1為對象，通過以枯草芽孢桿菌上的4個單氧化酶基因為基礎(chǔ)設(shè)計引物，克隆的4個基因均屬于枯草芽孢桿菌細胞色素P450家族，對4個基因的原核表達產(chǎn)物也符合預(yù)期蛋白大小。其中重組蛋白P-4具有肉桂酸4-羥基化酶（C4H）的活性，該酶的最適溫度范圍較寬，從25℃到40℃的活力都維持在較高的水平，這個結(jié)果與已報道的一些植物的C4H的性質(zhì)相似［6，7］。同時，通過添加不同濃度的酶和產(chǎn)物香豆酸，表明重組蛋白P-4的C4H活性能夠被產(chǎn)物反饋抑制，這個結(jié)果也與多數(shù)報道中的植物C4H相一致［7，8］。在一些植物中，苯丙烷途徑的苯丙氨酸解氨酶（PAL）和C4H共同構(gòu)成一個調(diào)控復(fù)合體，在植物遇到環(huán)境脅迫時能被誘導(dǎo)協(xié)同表達，在這個調(diào)控系統(tǒng)中，香豆酸也是催化第一步反應(yīng)的苯丙氨酸解氨酶的抑制劑，因此苯丙烷途徑受PAL，C4H活性的雙重調(diào)控［9-11］。由于C4H產(chǎn)生的香豆酸可以進入各分支途徑，產(chǎn)生各種活性物質(zhì)，因此內(nèi)生菌采用與植物相似的策略，通過產(chǎn)物濃度對苯丙烷途徑前兩步酶的調(diào)控，能更好的分配碳流，以應(yīng)對環(huán)境的脅迫。

原核生物的P450是一個多功能酶系，能夠催化羥化、氧化、脫水等多種反應(yīng)，該內(nèi)生枯草芽孢桿菌正是以P450酶系的P-4作為C4H的同工酶，通過其C4H活性進行苯丙烷途徑的肉桂酸羥基化反應(yīng)產(chǎn)生香豆酸，最終產(chǎn)生綠原酸，這符合在RP1發(fā)酵液中檢測到的肉桂酸和香豆酸的結(jié)果。但另外的3個P450酶是否具有C3'H活性，需要進一步實驗進行驗證。本課題組在以往的研究中，已確定了該內(nèi)生菌通過組氨酸解氨基酶（HAL）雙功能活性中的苯丙氨酸解氨基酶活性來使產(chǎn)物進入苯丙烷途徑［12］，本研究結(jié)果則證實，內(nèi)生菌進一步利用細胞色素P450家族的酶作為同工酶進行綠原酸合成的C4H反應(yīng)。

從以上研究結(jié)果來看，從產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌中克隆得到的兩個基因都具有綠原酸合成途徑的關(guān)鍵酶（PAL和C4H）基因活性，產(chǎn)生的相應(yīng)催化產(chǎn)物（肉桂酸和香豆酸）也與對內(nèi)生菌發(fā)酵液的LC-MS檢測結(jié)果一致，這說明該內(nèi)生菌的綠原酸合成途徑可能與植物的相似。內(nèi)生菌基因組遠比植物小，相比植物龐大的基因組以及大量的備用基因資源，內(nèi)生菌可供利用的資源極其有限，利用同工酶和多功能酶的形式，內(nèi)生菌就可以在專用酶分化較少的情況下，合成一些次生代謝產(chǎn)物以應(yīng)對環(huán)境變化的脅迫。這可能是由于和植物長期共生的內(nèi)生菌通過基因水平的傳遞，從植物中獲取了相應(yīng)的基因功能片段［13，14］，是內(nèi)生菌長期和植物共生進化而來的策略。

圖8 產(chǎn)物香豆酸濃度對重組蛋白P-4活性的影響

4 結(jié)論

通過對一株產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌的P450基因的克隆和功能研究，表明該內(nèi)生菌能利用其細胞色素P450酶系作為C4H的同工酶從而形成綠原酸合成的前導(dǎo)物——對香豆酸。

這種方式是內(nèi)生菌擴大基因功能的一種策略，同時也表明該內(nèi)生菌可能具有和植物相似的綠原酸合成途徑。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Function of Gene for Cytochrome P450 from a Chlorogenic Acid-producing Endophytic Bacterium

WANG Chuan1LI Li1WEI Pi-wei1HUANG Fei2
（1. College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong 643000；2. College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064）

Based on a chlorogenic acid-producing endophytic Bacillus subtilis，cloning and function of a key gene in the synthetic pathway of chlorogenic acid was studied. The cytochrome P450 gene of the endophyte was cloned and expressed in prokaryotic vector，and the cinnamate 4-hydroxylase（C4H）activity of the recombinant proteins were determined. Four cytochrome P450 genes were cloned and expressed in prokaryotic vector，and the recombinant protein P-4 presented C4H activity. The coumarate produced by the C4H activity was the same as the result measured by LC-MS. The activity of P-4 existed in a broad optimal temperature and was inhibited by product coumarate. It is supposed that，taking cytochrome P450 as isozyme of C4H，the endophyte led the product coumarate to the synthetic pathway of chlorogenic acid.

chlorogenic acid；cytochrome P450；C4H；expression；activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.026

2015-10-27

四川省教育廳理工科重點項目（14ZA0211）

王川，男，博士，研究方向：資源微生物，生物反應(yīng)器；E-mail：watpc57944@163.com