張智　唐娜　王玨　趙志河　譚理軍.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院正畸科（四川大學(xué)），成都 6004；.四川省人民醫(yī)院口腔科，成都 6007

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脈沖超聲及電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨分化過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)溢出的影響

張智1唐娜2王玨1趙志河1譚理軍1
1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院正畸科（四川大學(xué)），成都 610041；2.四川省人民醫(yī)院口腔科，成都 610072

[摘要]目的研究脈沖超聲以及脈沖電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微球體外成軟骨分化中細(xì)胞外基質(zhì)向培養(yǎng)基中溢出的影響。方法將干細(xì)胞微球在成軟骨培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分為無(wú)刺激組（N組）、脈沖超聲（100、150、200 mW·cm-2）刺激組和脈沖電磁場(chǎng)（1、2、5 mT）刺激組。2周后采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)培養(yǎng)液中Ⅱ型膠原和糖胺聚糖的質(zhì)量濃度。結(jié)果脈沖超聲刺激組細(xì)胞外基質(zhì)分泌較N組增多（P<0.05），但3個(gè)刺激組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；脈沖電磁場(chǎng)組對(duì)Ⅱ型膠原分泌無(wú)明顯影響（P>0.05），1 mT組對(duì)糖胺聚糖的分泌無(wú)明顯影響（P>0.05），2 mT和5 mT組糖胺聚糖的分泌減少（P<0.05）。結(jié)論在促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化的過(guò)程中，特定參數(shù)的脈沖電磁場(chǎng)可能起到防止增多的細(xì)胞外基質(zhì)向組織外擴(kuò)散溢出的作用。

[關(guān)鍵詞]脈沖超聲； 脈沖電磁場(chǎng)； 成軟骨分化； 細(xì)胞外基質(zhì)

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干細(xì)胞的成軟骨分化過(guò)程與物理刺激緊密相關(guān)。脈沖超聲（pulsed ultrasound，PUS）和脈沖電磁場(chǎng)（pulsed electromagnetic fields，PEMF）作為非侵入性的物理刺激，具有極佳的應(yīng)用前景[1-3]。El-Bialy 等[4]提取新西蘭兔股骨中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，擴(kuò)增后接種到膠原蛋白支架中，4周后，PUS刺激組番紅-O染色增強(qiáng)。Schumann等[5]使用成軟骨培養(yǎng)基體外成軟骨誘導(dǎo)人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微球，并在前7 d對(duì)實(shí)驗(yàn)組施加PUS刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每日40 min的PUS刺激組成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)除了在最初7 d降低外，之后都明顯增加。Esposito等[6]在體外通過(guò)成軟骨誘導(dǎo)結(jié)合Wharton’s膠的人臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PEMF明顯縮短成軟骨分化的時(shí)間，表明PEMF具有早期誘導(dǎo)臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的潛力。Chen等[7]將人脂肪源性干細(xì)胞接種于羥磷灰石和膠原蛋白支架進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，使用PEMF刺激1周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每日8 h的PEMF刺激可以使SRY基因相關(guān)高遷移率組家族-9、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖基因的表達(dá)增加，促進(jìn)ADSCs的成軟骨分化。由此可見(jiàn)，現(xiàn)有的多數(shù)體外研究均已證實(shí)PUS和PEMF可以促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程中軟骨特征性細(xì)胞外基質(zhì)合成。然而，在體外研究中細(xì)胞外基質(zhì)合成后，除了存在于培養(yǎng)體內(nèi)部，一部分還會(huì)被分泌到培養(yǎng)基中，以往的實(shí)驗(yàn)研究都忽略了這一重要組成部分。研究這部分細(xì)胞外基質(zhì)，可以探討PUS和PEMF是否有助于軟骨樣細(xì)胞外基質(zhì)儲(chǔ)存于培養(yǎng)體中?；谶@種設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典的無(wú)支架細(xì)胞微球?yàn)槌绍浌茄芯磕Ｐ蚚8]，采用臨床常用的PUS和PEMF參數(shù)設(shè)置，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）研究PUS及PEMF對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨分化，細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）分泌的影響。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1月齡雄性SD大鼠，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2細(xì)胞微球培養(yǎng)

脫頸處死大鼠，將股骨及脛骨骨髓組織懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后半換液棄去不貼壁的細(xì)胞，2 d全換液，之后每隔2～3 d換液，待原代細(xì)胞（P0）貼壁融合達(dá)80%～90%后，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物CD34、CD29、CD44 及CD45表達(dá)。使用P3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)15 mL無(wú)菌離心管移入約5×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，細(xì)胞沉淀后，加入成軟骨誘導(dǎo)液，于37 ℃、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)24 h，細(xì)胞沉淀聚集成球狀。

1.3PUS干預(yù)

將細(xì)胞微球培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每個(gè)孔加入2.5 mL成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，10個(gè)細(xì)胞微球，隨機(jī)分為無(wú)刺激組（N組）和刺激組（US組）。US組按刺激強(qiáng)度分為100、150、200 mW·cm-2共3組（分別為US1、US2、US3組），設(shè)置參數(shù)為：占空比20%，工作頻率1 mHz，重復(fù)頻率1 kHz，15 min·d-1。N組每天處理方式相同，但是不開(kāi)電源。

1.4PEMF干預(yù)

將細(xì)胞微球培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔加1 mL成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及4個(gè)細(xì)胞微球，設(shè)無(wú)刺激組（N組）和刺激組（PS組）。PS組按強(qiáng)度分為5、2和1 mT共3組（分別為PS1、PS2、PS3組），調(diào)制頻率為750 Hz，載波頻率為75 Hz，3 h·d-1。N組每天處理方式相同，但不開(kāi)電源。

1.5ELISA檢測(cè)

培養(yǎng)2周后收集各組培養(yǎng)液，編號(hào)后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)先通過(guò)離心提取上清液，然后進(jìn)行ELISA反應(yīng)。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，樣本可直接用于GAG的檢測(cè)，稀釋100倍后可用于Ⅱ型膠原蛋白的檢測(cè)。反應(yīng)終止后30 min內(nèi)置于酶標(biāo)儀450 nm下讀取光密度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在曲線上根據(jù)樣本OD值查找出樣本中該物質(zhì)的濃度，由此檢測(cè)各組細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原和GAG的含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞表型鑒定

原代培養(yǎng)72 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，多數(shù)梭形細(xì)胞聚集成團(tuán)，呈現(xiàn)克隆樣生長(zhǎng)的特點(diǎn)。培養(yǎng)5 d時(shí)，細(xì)胞相互融合，成片生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)2次傳代后，P2代細(xì)胞均為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，長(zhǎng)梭形并帶有多個(gè)細(xì)胞質(zhì)突起，保持克隆樣生長(zhǎng)的特點(diǎn)，生長(zhǎng)迅速，2～3 d即可以相互融合成片，局部成漩渦樣。原代培養(yǎng)的P3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況如下：CD34表達(dá)陰性（0.2%），CD45表達(dá)陰性（0.0%），CD29表達(dá)陽(yáng)性（99.7%），CD44表達(dá)陽(yáng)性（52.5%）。

2.2PUS干預(yù)對(duì)軟骨基質(zhì)分泌的影響

培養(yǎng)2周后收集的培養(yǎng)基內(nèi)含細(xì)胞微球最近3 d的代謝產(chǎn)物，經(jīng)ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示：US組和N組Ⅱ型膠原質(zhì)量濃度的總體均數(shù)為116.309 μg·mL-1，遠(yuǎn)高于GAG（2.483 μg·mL-1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1　PUS對(duì)干細(xì)胞微球成軟骨誘導(dǎo)2周時(shí)上清液中細(xì)胞外基質(zhì)質(zhì)量濃度的影響Fig 1　The effect of PUS on the content of extracellular matrix in the medium after 2 week

2.2.1PUS干預(yù)對(duì)Ⅱ型膠原分泌的影響PUS干預(yù)下，N、US1、US2、US3組分泌Ⅱ型膠原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為93.331、127.968、122.636、121.303 μg·mL-1（圖1）。經(jīng)單因素方差分析，4組質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步行SNK檢驗(yàn)，US1、US2、US3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但3個(gè)組與N組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2　PEMF對(duì)干細(xì)胞微球成軟骨誘導(dǎo)2周時(shí)上清液中細(xì)胞外基質(zhì)含量的影響Fig 2　The effect of PEMF on the content of extracellular matrix in the medium after 2 weeks

2.2.2PUS干預(yù)對(duì)GAG分泌的影響在PUS干預(yù)下，N、US1、US2、US3組分泌GAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.782、2.772、2.739、2.640 μg·mL-1（圖1）。經(jīng)單因素方差分析，4組質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步行SNK檢驗(yàn)，US1、US2、US3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但3個(gè)組與N組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3PEMF干預(yù)對(duì)軟骨基質(zhì)分泌的影響

培養(yǎng)2周時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，PS組和N組的Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)量濃度總體均數(shù)為88.743 μg·mL-1，遠(yuǎn)高于GAG（1.155 μg·mL-1，P＜0.05）（圖2）。

2.3.1PEMF干預(yù)對(duì)Ⅱ型膠原分泌的影響PEMF干預(yù)下，N、PS3、PS2、PS1組分泌Ⅱ型膠原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為92.334、87.763、90.935、83.940 μg·mL-1（圖2）。經(jīng)單因素方差分析，4組質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示PEMF對(duì)Ⅱ型膠原分泌無(wú)明顯影響。

2.3.2PEMF干預(yù)對(duì)GAG分泌的影響PEMF干預(yù)下，N、PS3、PS2、PS1組分泌GAG的質(zhì)量濃度分別為1.785、1.470、0.700、0.666 μg·mL-1（圖2）。經(jīng)單因素方差分析，4組質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；進(jìn)一步行SNK檢驗(yàn)，N組和PS3組中任一組GAG質(zhì)量濃度與PS2和PS1組的任一組均有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

由軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為Ⅱ型膠原和GAG。細(xì)胞外基質(zhì)沉積在細(xì)胞周圍，為軟骨細(xì)胞提供三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定[9]。Ⅱ型膠原和GAG表達(dá)的程度代表穩(wěn)定分化的軟骨細(xì)胞的功能活躍情況。其中，Ⅱ型膠原是透明軟骨的特征性細(xì)胞外基質(zhì)[10]，是軟骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一；GAG的代謝與軟骨細(xì)胞的功能狀態(tài)有密切關(guān)系。物理刺激可直接或間接影響干細(xì)胞成軟骨過(guò)程中Ⅱ型膠原合成及GAG合成及釋放[4-7]，因此定性定量研究干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅱ型膠原和GAG的變化情況，是研究物理刺激對(duì)干細(xì)胞成軟骨分化影響的重要途徑之一。研究[8]證實(shí)，物理刺激在干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程中可以促進(jìn)成軟骨培養(yǎng)體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的合成。物理刺激是否有利于合成的細(xì)胞外基質(zhì)儲(chǔ)存在培養(yǎng)體內(nèi)，防止溢出到培養(yǎng)基中尚缺乏科學(xué)的證明。

本研究發(fā)現(xiàn)，PUS促進(jìn)了成軟骨分化的干細(xì)胞微球向培養(yǎng)基中溢出Ⅱ型膠原和GAG。本研究還對(duì)不同強(qiáng)度PUS的促進(jìn)效果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100、150、200 mW·cm-2這3種強(qiáng)度的PUS相互之間的刺激作用無(wú)明顯差異，尚不能認(rèn)為PUS的強(qiáng)度會(huì)影響細(xì)胞外基質(zhì)向培養(yǎng)基中溢出。本課題組在前期研究[11]中發(fā)現(xiàn)，100、150和200 mW·cm-2的超聲均可使培養(yǎng)體內(nèi)部番紅-O染色增強(qiáng)，促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，尤其是在150、200 mW·cm-2的刺激下，Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)明顯高于100 mW·cm-2。由此可見(jiàn)，在本研究設(shè)置下，PUS可以促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨培養(yǎng)體系內(nèi)軟骨相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)合成和溢出增多，但是溢出增多的比例低于其合成增加的比例，尤其是在150和200 mW·cm-2的超聲刺激下。

1、2、5 mT PEMF刺激對(duì)干細(xì)胞微球向培養(yǎng)基中合成分泌Ⅱ型膠原無(wú)顯著影響，2、5 mT組降低了干細(xì)胞微球向培養(yǎng)基中分泌GAG。本課題組在前期研究[12]中發(fā)現(xiàn)，只有5 mT的PEMF可使培養(yǎng)體內(nèi)GAG表達(dá)降低，1、2 mT的PEMF對(duì)GAG的表達(dá)無(wú)明顯影響，同時(shí)PEMF對(duì)培養(yǎng)體內(nèi)Ⅱ型膠原的表達(dá)也無(wú)明顯影響。結(jié)合本研究結(jié)果可見(jiàn)，PEMF在促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化并合成細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，2 mT 的PEMF刺激可能參與阻止其向培養(yǎng)基中溢出。

本研究發(fā)現(xiàn)，PUS可以促進(jìn)成軟骨分化干細(xì)胞微球向培養(yǎng)基中分泌Ⅱ型膠原和GAG，其促進(jìn)作用強(qiáng)于PEMF，并且與PUS強(qiáng)度無(wú)關(guān)。PEMF在促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化的過(guò)程中，其機(jī)制可能不僅僅局限于促進(jìn)軟骨樣細(xì)胞外基質(zhì)的合成，還可能參與了防止增多的細(xì)胞外基質(zhì)向組織外溢出的作用，從而更有效地促進(jìn)細(xì)胞微球等培養(yǎng)體成軟骨分化；但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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（本文編輯吳愛(ài)華）

·口腔微生物學(xué)專欄·

Effects of pulsed ultrasound and pulsed electromagnetic field on the extracellular matrix secretion of rat bone marrow mesenchymal stem cell pellets in chondrogenesis

Zhang Zhi1, Tang Na2, Wang Jue1, Zhao Zhihe1, Tan Lijun1.(1.State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept.of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China;2.Dept.of Stomatology, People’s Hospital, Sichuan Province, Chengdu 610072, China)

[Key words]pulsed ultrasound;pulsed electromagnetic field;chondrogenesis;extracellular matrix

[Abstract]Objective To study the effects of pulsed ultrasound (PUS) and pulsed electromagnetic fields (PEMF) on the secretion of extracellular matrix from a culture complex during in vitro chondrogenesis.MethodsAll the rat bone marrow mesenchymal stem cell pellets were cultured in achondrogenic medium.Different intensities of PUS (100, 150, and 200 mW·cm-2) and PEMF (1, 2, and 5 mT) were applied to the cell pellets for 2 weeks.Group N was cultured without PUS and PEMF stimulation as control.The culture medium was collected after 2 weeks of culture.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the type of collagen and glycosaminoglycan (GAG) in the culture medium.ResultsPUS increased the secreting-type collagen and GAG from cell pellets compared with group N (P<0.05), whereas there was no difference in different intensities (P>0.05).PEMF had no significant effect on the secretion of the type of collagen (P>0.05).A PEMF of 1 mT had no significant effect on the secretion of GAG (P>0.05).A PEMF 2 and 5 mT decreased the secretion of GAG (P<0.05).ConclusionTo prevent the secretary of extracellular matrix may play a role in chondrogenic effect of PEMF.

[中圖分類號(hào)]R 783.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.015

[收稿日期]2015-12-16； [修回日期]2016-02-01

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（30900287，81030034，30900286）

[作者簡(jiǎn)介]張智，碩士，E-mail：263687654@qq.com

[通信作者]譚理軍，副教授，博士，E-mail：orthotan@vip.163.com