朱春超，談鳳笑，劉瑩，強(qiáng)寅夢，施蘇華，黃椰林（.中山大學(xué)　生命科學(xué)學(xué)院　廣東省植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　廣州　5075；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)　資源環(huán)境學(xué)院，廣東　廣州　5064）

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紅樹植物角果木屬的分子系統(tǒng)發(fā)育研究

朱春超1，談鳳笑2，劉瑩1，強(qiáng)寅夢1，施蘇華1，黃椰林1
（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510642）

摘要：運(yùn)用PCR產(chǎn)物直接測序法測定了紅樹科（Rhizophoraceae）角果木屬（Ceriops）5個(gè)物種24個(gè)個(gè)體加上外類群木欖共125個(gè)序列，包括rpl20-rps12，atpB-rbcL，trnL intron，trnL-trnF，trnT（UGU）-trnL（UAA）共5段葉綠體非編碼區(qū)，序列總長度為2716 bp?；谝陨虾喜⑿蛄?，采用最大簡約法、貝葉斯法和鄰接法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)出高度一致的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果顯示：角果木屬包含兩個(gè)大的分支：（1）角果木C. tagal和澳洲角果木C. australis構(gòu)成一個(gè)分支；（2）十雄角果木復(fù)合體內(nèi)的3個(gè)物種（十雄角果木C. decandra、齊氏角果木C. zippeliana和擬十雄角果木C. pseudodecandra）組成另一分支，其中齊氏角果木和擬十雄角果木為姊妹種，該分支3個(gè)物種相互之間的遺傳距離均顯著大于傳統(tǒng)物種角果木和澳洲角果木之間的遺傳距離，并且每個(gè)物種的單系性在系統(tǒng)樹上均得到強(qiáng)烈支持。研究結(jié)果支持了Sheue在最近研究中關(guān)于該屬物種地位的處理，進(jìn)一步探討了角果木屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與該屬生物地理分布模式之間的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：紅樹植物；角果木屬；分子系統(tǒng)發(fā)育

紅樹科（Rhizophoraceae）角果木屬（Ceriops）是熱帶亞熱帶海岸紅樹林植物類群中的重要樹種，是以印度-西太平洋地區(qū)為分布中心的代表性真紅樹植物。該屬植物葉片呈光滑偏黃綠色，故被稱為“yellow mangrove”（Tomlinson，1986）；傳統(tǒng)上該屬分為3種：十雄角果木C. decandra、角果木C. tagal、澳洲角果木C. australis，其中以角果木和十雄角果木分布最廣，其分布范圍從非洲東岸、馬達(dá)加斯加向東經(jīng)熱帶亞洲和澳大利亞直至美拉尼西亞（Tomlinson，1986）；澳洲角果木分布范圍很窄，僅限于澳大利亞、新幾內(nèi)亞及其鄰近島嶼。中國僅有角果木1種，其南部沿海是該種世界分布的北緣（Duke，1992）。最新的調(diào)查表明其分布范圍由原來的廣西、海南、廣東直至臺(tái)灣南部縮減為僅有的海南、廣東兩?。愋∮碌?，2000；梁士楚，2000；王文卿等，2007）。近年來，隨著印度西太平洋地區(qū)海岸紅樹植物實(shí)地調(diào)查的不斷深入和植物材料的重新整理和審視，角果木屬的系統(tǒng)發(fā)育研究有了新的進(jìn)展，有研究顯示傳統(tǒng)上所認(rèn)為的十雄角果木可能為一個(gè)物種復(fù)合體（species complex），能進(jìn)一步根據(jù)形態(tài)特征劃分為3個(gè)物種（十雄角果木C. decandra，齊氏角果木C. zippeliana，擬十雄角果木C. pseudodecandra）（Sheue et al，2009a；Sheue et al，2010）。但這種物種劃分尚未得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，各物種之間的關(guān)系也存在矛盾和疑問（Tsai et al，2012）。此外，該屬植物物種之間形態(tài)差異相對(duì)較小，各種性狀往往相互交叉，種間界限難以區(qū)分，分類和鑒定非常困難。因此利用新的證據(jù)進(jìn)一步的開展角果木屬的系統(tǒng)發(fā)育研究無疑是該屬研究的重要方向。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，合理的分子標(biāo)記被認(rèn)為能較為客觀地提供植物類群中的系統(tǒng)發(fā)育信息并解決形態(tài)特征上的趨同進(jìn)化干擾。其中葉綠體基因組中的內(nèi)含子和基因間隔區(qū)因?yàn)榫鶎俜蔷幋a序列，進(jìn)化速率快，常被用于探討屬間或?qū)傧骂惾旱南到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系。常用的葉綠體非編碼區(qū)域包括rpl20-rps12，atpB-rbcL，trnLintron，trnL-trnF，trnT （UGU）-trnL（UAA）等。本研究旨在利用上述序列探討角果木屬植物種間親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并為相關(guān)物種的界定提供分子水平上的證據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用植物材料包括角果木屬24個(gè)個(gè)體，按Sheue等（2010）的形態(tài)特征描述分別屬于5個(gè)不同的物種（表1），并基于前人的研究結(jié)果（Huang et al，2008）采用木欖作為本研究的外類群。采樣時(shí)間跨度為2004-2013年，系本文作者所在實(shí)驗(yàn)室在多年的針對(duì)印度-西太平洋沿岸地區(qū)各種紅樹植物的實(shí)地采樣過程中不斷采集得到。角果木屬內(nèi)每種植物均包含3-6個(gè)分布在不同地理群體里的個(gè)體，目的是初步估計(jì)并比較物種內(nèi)的遺傳多態(tài)性水平。野外采集時(shí)將所采植物的新鮮葉片材料用硅膠快速干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室干燥柜中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。憑證標(biāo)本存于中山大學(xué)標(biāo)本館。

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取總DNA（Doyle et al，1987）。所提樣品DNA均存放在零下八十度超低溫冰箱凍存。

1.3葉綠體序列的擴(kuò)增、純化及測序

葉綠體片段PCR擴(kuò)增的引物來自Taberlet等（1991），Hodges等（1994）和Hamilton（1999）。反應(yīng)體系為20 μl，包括DNA 20-40 ng，引物0.15 μmol/L，MgCl221.5 mol/L，dNTP 0.1 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，5 min→94℃，45 s→56℃，50 S→72℃，80 s→32個(gè)循環(huán)→72℃，6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后直接測序，測序引物與PCR反應(yīng)引物相同，采用雙向測序。

1.4序列分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建

所測序列經(jīng)人工校正后提交至GenBank（登錄號(hào)見表1，所有125個(gè)序列均為本研究所測），進(jìn)一步采用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行排序和格式轉(zhuǎn)換后，采用PAUP（Phylogenetic Analysis Using Parsimony）Version 4.0進(jìn)行最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）構(gòu)樹，空位（gap）處理為缺失狀態(tài)。采用啟發(fā)式搜尋，TBR枝長交換以及500次隨機(jī)序列加入尋找最大簡約樹。采用自展分析（bootstrap）檢驗(yàn)簡約樹中各分支的置信度，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。貝葉斯樹（Bayesian inference，BI）的構(gòu)建則采用Mrbayes V3.0 b4軟件包完成。在構(gòu)樹前先采用Modeltest V 3.06獲取最佳核苷酸替代模型，并估計(jì)相關(guān)參數(shù)。貝葉斯法所用Markov Chain Monte Carlo（馬爾可夫鏈蒙特卡洛，MCMC）參數(shù)如下：以隨機(jī)樹為起始樹，number of generations（代數(shù)）= 1000000，number of chains（鏈數(shù)）= 4，sample frequency（取樣頻率）= 100，MCMC達(dá)到平衡后，舍棄老化樣本數(shù)（burnin）占總數(shù)的25%，系統(tǒng)樹各分支的置信度以后驗(yàn)概率（Posterior Probability，PP）的形式來體現(xiàn)。此外，應(yīng)用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）Version 5來計(jì)算種間遺傳距離以及種內(nèi)的遺傳多態(tài)性水平，遺傳距離模型選擇Kimura 2-parameter模型，并進(jìn)行鄰接法構(gòu)樹（Neighbor-Joining，NJ）。NJ樹同樣采用自展值檢驗(yàn)分支的置信度，自展數(shù)據(jù)集為1000次。

表1　實(shí)驗(yàn)材料來源及GenBank序列號(hào)

表2　基于5個(gè)葉綠體非編碼區(qū)合并序列的角果木屬物種間遺傳距離和種內(nèi)多態(tài)性

2　結(jié)果

所分析樣品的5個(gè)葉綠體非編碼區(qū)段的序列矩陣經(jīng)Clustal X 1.8排列后總長為2716 bp。由于葉綠體在遺傳上是作為一個(gè)整體（單倍型）。因此，我們將同一樣品的所有5個(gè)葉綠體非編碼區(qū)段的序列數(shù)據(jù)合并進(jìn)行分析，以最大程度獲取系統(tǒng)發(fā)育的信息。利用Kimura 2-parameter模型計(jì)算得到的物種間的遺傳距離見表2，角果木屬植物間的遺傳距離介于0.003～0.027，遺傳距離最近的兩個(gè)物種是角果木與澳洲角果木（0.003），遺傳距離最遠(yuǎn)的兩個(gè)物種是角果木（澳洲角果木）與十雄角果木C. decandra之間（均為0.027）。十雄角果木物種復(fù)合體所包含的3個(gè)物種相互之間的遺傳距離介于0.010～0.019之間，均大于角果木與澳洲角果木之間的遺傳距離。物種內(nèi)的遺傳多態(tài)性檢測結(jié)果見表2，分析結(jié)果表明5個(gè)物種的遺傳多樣性水平均較低。角果木、澳洲角果木與擬十雄角果木沒有檢測到多態(tài)性，而十雄角果木C. decandra和齊氏角果木C. zippeliana的種內(nèi)多態(tài)性水平均為千分之一。

最大簡約分析共有109個(gè)信息位點(diǎn)，采用啟發(fā)式搜尋最終得到26棵最簡約樹，步長為183，一致性指數(shù)（CI）和維持性指數(shù)（RI）分別為0.956 和0.986。圖2為其嚴(yán)格一致樹并給出了重復(fù)1000次計(jì)算所得到的各分支的Bootstrap值。應(yīng)用Modeltest進(jìn)行模型選擇所選的最適替代模型為GTR + G，由該程序所獲得的替代模型參數(shù)運(yùn)用在下一步的貝葉斯構(gòu)樹分析中。貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果見圖3，各分支的后驗(yàn)概率值（PP）也同時(shí)列出。比較最大簡約法、貝葉斯法和鄰接法（未列出）的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方法所分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上高度一致，角果木屬植物均分為兩個(gè)大的分支：（1）角果木和澳洲角果木構(gòu)成一個(gè)分支；（2）屬內(nèi)其余植物，即十雄角果木復(fù)合體內(nèi)的3個(gè)物種組成另一分支，該分支中齊氏角果木和擬十雄角果木為姊妹種，而十雄角果木與兩者的關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖2，3），在分支的支持率上，屬內(nèi)各物種的對(duì)應(yīng)分支均得到極高的支持，其單系性均得到驗(yàn)證。

3　討論

角果木屬作為紅樹科海岸紅樹林植物4屬之一，具有典型的紅樹植物形態(tài)特征，例如胎萌和發(fā)達(dá)的根系等等，以適應(yīng)于海岸潮間帶生境（Tomlinson，1986）。但該屬的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究則一直存在爭議。Hou（1958）認(rèn)為該屬存在兩個(gè)種：十雄角果木C. decandra（Griff.）Ding Hou和角果木C. tagal（Perr.）C. B. Robinson。White （1926）和Tomlinson（1996）則進(jìn)一步在澳大利亞、新幾內(nèi)亞及其鄰近島嶼鑒定出一個(gè)新的變種C. tagal（Perr.）C. B. Rob. var. australis C. T. White。Ballment等（1988）通過進(jìn)一步的等位酶分析，將該亞種由亞種地位上升為種，命名為澳洲角果木C. australis（C. T. White）E. R. Ballment，T. J. Smith & J. A. Stoddart。目前澳洲角果木的種的地位已得到較多研究結(jié)果的支持（Duke，2006；Huang et al，2008；Sheue et al，2009b）。在形態(tài)特征上，角果木與澳洲角果木非常相似，最顯著的區(qū)別在于胎生苗（胚軸）的形態(tài)，前者的胎生苗有棱角，而后者為圓柱狀（Sheue et al，2009b）。本研究的分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果同樣支持了角果木與澳洲角果木各自的單系類群地位（100%支持率，圖2，3），以及兩種之間的姊妹群關(guān)系。這兩個(gè)種組成了角果木屬的第一大分支（100%支持率）。另外值得注意的是，本研究中的6個(gè)角果木個(gè)體分別來自不同地理區(qū)域的群體（包括東印度洋沿岸，西太平洋沿岸和澳大利亞），在一定程度上反映了角果木的分布范圍。而種內(nèi)多態(tài)性分析的結(jié)果表明，角果木作為該屬分布最廣的種，與分布區(qū)狹窄的澳洲角果木相比其種內(nèi)多樣性水平卻都接近于零（表2），盡管這只是基于少數(shù)個(gè)體水平上的初步估計(jì)，但這一結(jié)果同樣印證了Huang等（2012）對(duì)角果木群體遺傳研究的結(jié)果，表明該物種存在一定程度上的遺傳瓶頸效應(yīng)。

圖1　角果木屬物種和外類群的樣品地理分布圖

圖2　基于葉綠體合并序列的角果木屬最大簡約樹（MP）

圖3　基于葉綠體合并序列的角果木屬貝葉斯樹（BI）

在本研究的分子系統(tǒng)發(fā)育樹中角果木屬的第2大分支對(duì)應(yīng)著傳統(tǒng)意義上的角果木屬的第3個(gè)種：十雄角果木C. decandra（Griff.）Ding Hou。其支持率也達(dá)到了100%。但該分支進(jìn)一步分化成3個(gè)亞分支；分別對(duì)應(yīng)著3個(gè)經(jīng)重新界定和命名的物種（Sheue et al，2010）：這3個(gè)種的重新界定和命名主要是基于形態(tài)學(xué)上的考量。Sheue等（2009a；2010）在印度西太平洋地區(qū)海岸紅樹植物實(shí)地調(diào)查過程中對(duì)角果木屬的植物材料進(jìn)行了重新整理審視，認(rèn)為基于萼筒形狀，花瓣被毛特征和花的數(shù)目等特征可以把傳統(tǒng)意義上的十雄角果木劃分為3個(gè)種，十雄角果木C. decandra（Griff.）Ding Hou，齊氏角果木C. zippeliana Blume和擬十雄角果木C. pseudodecandra Sheue，Liu，Tsai & Yang。具體來說，十雄角果木的花萼呈現(xiàn)半球型，5～9 mm高；子葉下胚軸長8～13 cm、寬0.5～0.7 cm，頂端較圓。而齊氏角果木的花萼則呈較淺的圓盤型，2-3mm高；子葉下胚軸長9～17 cm、寬0.7～0.8 cm，頂端尖銳。擬十雄角果木花萼也是半球形，高度介于十雄角果木和齊氏角果木之間，4～5 mm；子葉下胚軸長10～16 cm、寬0.5～0.8 cm，頂端極其尖銳（Sheue et al，2010）。但在進(jìn)一步的實(shí)地采樣中發(fā)現(xiàn)這些特征上的差異仍然相對(duì)較小，各種性狀往往相互交叉。因此利用分子序列上的證據(jù)來進(jìn)一步驗(yàn)證這些物種是非常有必要的，盡管在劃分這些物種時(shí)，Sheue等（2009a；2010）也采用了分子數(shù)據(jù)，但均基于一個(gè)基因片段，分辨率和可靠性存在疑問，也沒有足夠的支持率回答這3個(gè)種哪兩個(gè)為姊妹種的問題?，F(xiàn)在重建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹基于5個(gè)葉綠體分子片段，其所蘊(yùn)含的分子系統(tǒng)發(fā)育信息非常清晰的將這3個(gè)種分開成獨(dú)立的3個(gè)分支，其中齊氏角果木和擬十雄角果木為姊妹種。而且這些分支之間的遺傳距離取值都在0.010以上，均大于兩個(gè)廣泛接受的物種即角果木與澳洲角果木之間的遺傳距離0.003，這進(jìn)一步支持了這些分支所代表的種的物種地位。

將本研究所獲得分子系統(tǒng)發(fā)育樹與各物種現(xiàn)有的地理分布相結(jié)合，會(huì)發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體中存在一個(gè)明顯的生物地理模式：即異域式物種形成模式。在印度-西太平洋地區(qū)，由于紅樹植物（尤其是紅樹科植物）的胎生苗是通過海洋進(jìn)行傳播的，因此普遍認(rèn)為該地區(qū)由于海平面升降所形成的幾處陸地障礙會(huì)影響紅樹植物的分化乃至物種形成（Huang et al，2008；Benzie et al，1998；Benzie et al，1999；Liao et al，2007）。其中馬來半島和印度尼西亞群島作為歷史上在該地區(qū)曾出現(xiàn)的基因流地理障礙對(duì)該地區(qū)的紅樹植物的遺傳分化可能有著顯著的影響（Huang et al，2008；Tan et al，2005）。在本研究中所揭示的分子系統(tǒng)發(fā)育樹中，十雄角果木，齊氏角果木和擬十雄角果木這3個(gè)種的地理分布恰好對(duì)應(yīng)著這兩個(gè)歷史地理障礙所分割的區(qū)域：十雄角果木的分布范圍是印度，孟加拉，緬甸和泰國西海岸；齊氏角果木的分布范圍大致是馬來半島東岸和南岸，南中國海周邊，菲律賓，以及印尼的北部和中部地區(qū)；擬十雄角果木的分布范圍限于澳大利亞，巴布亞新幾內(nèi)亞和印尼的南部部分地區(qū)（Sheue et al，2010）。這一分布模式暗示著由歷史上的幾次隔離分化事件驅(qū)動(dòng)了相應(yīng)的物種形成，并且進(jìn)一步可由在系統(tǒng)樹上3個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系推論出馬來半島所引起的隔離分化事件相對(duì)更早。歷史上，由馬來半島所引起的異域式物種形成在該地區(qū)已有記錄和研究（Tomlinson，1986）。例如紅樹植物阿吉木屬Aegialitis的一個(gè)種A. annulata僅分布在馬來半島的印度洋一側(cè)，而它的姊妹種A. rotundifolia則分布在馬來半島的太平洋一側(cè)（Duke，2006）。是否該地區(qū)有更多的紅樹植物具有類似的物種形成模式？同時(shí)，本屬另一個(gè)廣泛分布的物種（角果木）為何在這些區(qū)域之間沒有顯著的遺傳隔離模式？對(duì)這些問題的探索是進(jìn)一步研究的方向，而采用多基因的序列在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上進(jìn)行物種界定與物種形成分析的研究是回答這些問題所必需的，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。

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（本文編輯：李曉光）

Molecular phylogeny of mangrove genus Ceriops（Rhizophoraceae）

ZHU Chun-chao1，TAN Feng-xiao2，LIU Ying1，QIANG Yin-meng1，SHI Su-hua1，HUANG Ye-lin1
（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources，School of Life Sciences，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510275，China；2. South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Abstract：Five non-coding regions of chloroplast，including rpl20-rps12，atpB-rbcL，trnL intron，trnL-trnF and trnT （UGU）-trnL（UAA），from 24 individuals of five species in Ceriops and one outgroup species Bruguiera gymnorrhiza in Rhizophoraceae were determined by sequencing their PCR products directly. All 125 sequences of the five non-coding regions from different species were aligned and resulted in 2716 bp. The maximum parsimony，Bayesian inference and neighbor-joining methods were adopted to reconstruct molecular phylogeny of Ceriops based on the combined sequences，respectively. All phylogenetic trees showed consistent topology which revealed two clades in Ceriops，including one clade consisting of C. tagal and C. australis，and the other clade corresponding to C. decandra complex（C. decandra，C. pseudodecandraand C. zippeliana）. The pairwise genetic distances among species of C. decandracomplex were significantly higher than those between two well-recognized species C. tagal and C. australis. And the monophyly of different species and the sistership of C. pseudodecandraand C. zippelianawere well supported. Our result supported Sheue's recent studies on the treatment of these species status in Ceriops. The article further discussed the association between the molecular phylogeny and the biogeographical model in Ceriops.

Keywords：mangrove；Ceriops；molecular phylogeny

中圖分類號(hào)：P735；Q941

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-6932（2016）02-0209-07

Doi：10.11840/j.issn.1001-6392.2016.02.012

收稿日期：2015-01-25；

修訂日期：2015-06-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（41276107；31200466；J1210074；J1310025）；廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313136）。

作者簡介：朱春超（1986-），女，博士研究生，主要從事分子生態(tài)學(xué)研究。電子郵箱：zhuchunchao11@163.com。

通訊作者：黃椰林，博士，副教授。主要從事紅樹植物分子生態(tài)與群體遺傳研究。電子郵箱：lsshyl@mail.sysu.edu.cn。