細(xì)辛腦注射制劑異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)研究

鄧 莎，張德波，羅 潔，鄭嬌嬌，鄭 萍，蒲旭峰（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

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細(xì)辛腦注射制劑異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)研究

鄧 莎，張德波，羅 潔，鄭嬌嬌，鄭 萍，蒲旭峰
（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

【摘要】目的 測定細(xì)辛腦注射制劑靜脈給藥的小鼠LD50值，同時起草本品異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用加權(quán)回歸機率單位法（Bliss法）對小鼠靜脈給藥測定LD50值，同時按照《中國藥典》2010年版要求確定異常毒性檢查限值，起草異常毒性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果 測定細(xì)辛腦注射制劑的小鼠LD50為51. 9－153. 1 mg/ kg，為標(biāo)準(zhǔn)中擬增加異常毒性檢查項，異常毒性檢查項的限值建議定為15 mg/ kg，按此限值檢查結(jié)果符合規(guī)定。結(jié)論 細(xì)辛腦注射制劑毒性較大，各企業(yè)生產(chǎn)工藝不同毒性也差異較大，為減少本品臨床使用不良反應(yīng)的發(fā)生，應(yīng)在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加異常毒性檢查項。

【關(guān)鍵詞】細(xì)辛腦；異常毒性；LD50；限值；標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)辛腦主要存在于天南星科植物石菖蒲（acorus graninues soland）等植物的揮發(fā)油中。我國從七十年代開展對石菖蒲的藥理、毒理作用以及有效成分的提取、合成等方面的研究取得了重大的進(jìn)展，進(jìn)入80年代后，我國人工合成α-細(xì)辛腦成功，陸續(xù)制成片劑、膠囊劑和注射劑投放市場。細(xì)辛腦有很強的藥理活性，具有抗菌消炎、止咳、祛痰、平喘、鎮(zhèn)靜、解痙、抗驚厥、抗癲癇等藥理作用。近年來，不乏發(fā)生細(xì)辛腦注射劑的不良反應(yīng)/事件，其不良反應(yīng)/事件主要為全身性損害、皮膚及其附件損害、胃腸系統(tǒng)損害等［1－3］。細(xì)辛腦注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)繁多，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求較低，國內(nèi)外藥典尚未收載該品種?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中安全性檢查項個別標(biāo)準(zhǔn)只收載了熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項，按照化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則的建議，考慮到其在生產(chǎn)過程中引入或其它原因所致的毒性，故擬增加異常毒性檢查項，開展了本品LD50測定，并根據(jù)測定值確定了異常毒性檢查限值，建立了異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1藥品 共15批細(xì)辛腦注射制劑，包括注射用細(xì)辛腦6批（企業(yè)1，批號1403063、1303211；企業(yè)2，批號1308271；企業(yè)3，批號20140304、20140505；企業(yè)4，批號1312231；企業(yè)5，131108A1、140403E1；企業(yè)6，12140306、12140307）；細(xì)辛腦注射液9批（企業(yè)1，批號1402053、1402273；企業(yè)2，批號1312175、1311265；企業(yè)7，批號140507、130601；企業(yè)8，批號131015、131024；企業(yè)9，批號130902、131202；企業(yè)10，批號1311090、1311060；企業(yè)11，批號131002、131005；企業(yè)12，批號140317、140319；企業(yè)13，批號140401、140507）。

1.1.2儀器 電子秤PB1501-S 分辨值0. 1 g （Mettler Toledo Group）；高壓滅菌器HV-110 （HIRAYAMA）；十段編程鼓風(fēng)干燥箱ZRD-A7140（上海智城分析儀器制造有限公司）。用具：鼠盒、試管架、秒表、天平、75%酒精棉球、鑷子、鼠固定器、燒杯、注射針頭、注射器。

1.1.3試劑 5%葡萄糖注射液，規(guī)格：250 mL；批號：A14050206-1，有效期至2017年4月，四川科倫藥業(yè)股份有限公司。10%葡萄糖注射液，規(guī)格：500 mL，批號：14032567，有效期至2016年3月24日，四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司。滅菌注射用水，規(guī)格：500 mL，批號：130726103，有效期至2015年7月26日，四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司。

1.1.4動物 昆明種小鼠清潔級825只，4周齡，體重17～21 g，雌雄各半，雌性無孕，由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司提供【SCXK（川）2011－ 008】；小鼠雌雄分開飼養(yǎng)，每籠5只。實驗動物在成都市食品藥品檢驗研究院藥理實驗潔凈動物室進(jìn)行實驗以及觀察和飼養(yǎng)【SYXK（川）2014－097】。該項實驗通過成都市食品藥品檢驗研究院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，審查編號為：2014－003；并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。飼料，全價顆粒飼料，四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，其質(zhì)量符合GB14924. 1－2001《實驗動物配合飼料通用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2方法

1.2.1急性毒性測定（LD50測定）

采用加權(quán)回歸機率單位法（Bliss法）［4］，對每一企業(yè)不同制劑，用5%或10%葡萄糖注射液溶解并配制成一系列不同濃度供試液進(jìn)行預(yù)試，找出動物全死與全不死劑量，通過預(yù)試結(jié)果設(shè)計正式試驗的劑量。取禁食不禁水8 h的健康活潑、體重為19～21 g小鼠靜脈注射給藥，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，每只小鼠靜脈注射0. 8 mL，立即觀察記錄，共觀察7 d。

1.2.2異常毒性標(biāo)準(zhǔn)起草［7］

1.2.2.1劑量設(shè)定

《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪⅩM“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”異常毒性檢查項下對限值設(shè)定的規(guī)定［5］，同時考慮標(biāo)準(zhǔn)的普遍適用性，取本品6個較小LD50值（51. 86－72. 40 mg/ kg）的平均值的可信限下限的1/4作為設(shè)定異常毒性限值的參考值。該值為14. 67 mg/ kg，取整數(shù)為15 mg/ kg。異常毒性檢查時供試液配制成0. 6 mg/ mL，每只小鼠靜脈注射0. 5 mL。

1.2.2.2供試液的溶血與凝聚考查［8］

取家兔心臟血，脫纖，離心洗滌至上清液不顯紅色，取分離紅細(xì)胞用氯化鈉注射液配成2%的混懸液備用。取各企業(yè)的細(xì)辛腦注射制劑，加5%或10%葡萄糖注射液溶解并配制成0. 6 mg/ mL的溶液，按照我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行溶血與凝聚常規(guī)檢驗，依法操作（表1）。

1.2.2.3標(biāo)準(zhǔn)起草

異常毒性 取本品，用5%或10%葡萄糖注射液制成每1 mL含細(xì)辛腦0. 6 mg的溶液，依法檢查（中國藥典2010年版二部附錄XI C）［4－6］，按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。

1.2.2.4樣品異常毒性常規(guī)檢查

取每一企業(yè)樣品1批（共15批），分別用5%葡萄糖注射液制成每1 mL含細(xì)辛腦0. 6 mg的溶液作為供試液。

取禁食不禁水8 h，體重為17～20 g的健康活潑小鼠，靜脈注射給藥，注射劑量為每只小鼠注射0. 5 mL，注射速度為5 s，每一批樣品共注射5只。注射畢立即觀察，記錄動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，共觀察48 h。

表1　細(xì)辛腦注射制劑溶血與凝聚檢驗加樣方法Tab. 1 Asarone injection preparation hemolysis and coagulation test methods

表2　細(xì)辛腦注射制劑急毒性（LD50）測定結(jié)果Tab. 2 Acute toxicity（LD50）results of asarone injection preparation

1. 3 統(tǒng)計分析

采用加權(quán)回歸機率單位法（Bliss法）對小鼠靜脈給藥測定LD50值［4］。

2　結(jié)果

2.1急性毒性測定（LD50測定）

表2顯示，每一企業(yè)的細(xì)辛腦注射制劑均測出了LD50。其結(jié)果：細(xì)辛腦注射液LD50為51. 9～123. 2 mg/ kg；注射用細(xì)辛腦LD50為57. 0～153. 1 mg/ kg。

2.2異常毒性標(biāo)準(zhǔn)起草

2.2.1供試液的溶血與凝聚考查

試驗結(jié)果，陰性和陽性對照管均成立，供試品管上層液與供試液顏色對照管（第4管）的溶液顏色接近，所有供試液均未引起溶血與凝聚作用。即本品異常毒性檢查的0. 6 mg/ mL供試液不會引起溶血與凝聚作用。

2.2.2樣品異常毒性常規(guī)檢查

表3顯示，15批細(xì)辛腦注射制劑靜脈注射后，動物均無明顯異常反應(yīng)，也未見死亡，觀察48 h動物均存活，健康活潑。實驗認(rèn)為，各企業(yè)生產(chǎn)的細(xì)辛腦注射制劑異常毒性檢查能夠滿足本研究起草的標(biāo)準(zhǔn)要求。

圖1　注射用細(xì)辛腦LD50測定計算圖（企業(yè)1，16 mg，1403063）Fig. 1 The determination of asarone for injection LD50calculation chart（Co. 1，16mg，1403063）

圖2　細(xì)辛腦注射液LD50測定計算圖（企業(yè)1，2 mL：8 mg，1402053）Fig. 2 The determination of asarone injection LD50calculation chart（Co. 1，2 mL：8 mg，1402053）

表3　異常毒性檢驗記錄表Tab. 3 Abnormal toxicity test record

3　討論

本研究是2014年我院承擔(dān)的2014年國家藥品計劃抽驗“細(xì)辛腦注射制劑”研究，共抽取了國內(nèi)13家企業(yè)的細(xì)辛腦注射液和注射用細(xì)辛腦126批樣品。本研究主要是考查細(xì)辛腦注射劑毒性情況，同時建立異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)。

本品臨床使用說明書中標(biāo)注測定LD50小鼠口服為680. 5±41. 4 mg/ kg、腹腔注射為388. 7±28. 5 mg/ kg。此二種測定方法與本品臨床靜脈給藥方法不一致，其結(jié)果不能代表本品的真實毒性。本研究采用靜脈給藥法測定LD50為51. 9～153. 1 mg/ kg，與說明書中的值差別較大。《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪⅩM“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”關(guān)于異常毒性檢查的劑量設(shè)定，建議限值至少應(yīng)小于LD1可信限下限的1/3（建議采用1/3－1/6）；如難以計算最低致死量，可采用小于LD50可信限下限的1/4（建議采用1/4－1/8）；如半數(shù)致死量與臨床體重劑量之比小于20，可采用可信限下限的1/4或LD1可信限下限的1/3。本研究在起草細(xì)辛腦注射制劑的異常毒性標(biāo)準(zhǔn)時，設(shè)定劑量為6個較低LD50值平均值的可信限下限的1/4，與其他較大LD50值平均值的可信限下限的1/8基本相當(dāng)，符合藥典以上規(guī)定要求［5］。在對細(xì)辛腦注射制劑異常毒性標(biāo)準(zhǔn)研究中，采用小鼠為受試動物，確定了異常毒性檢查限值，該限值為本品臨床成人一日最大用藥劑量的30倍。通過測定的LD50，按照藥典要求起草了異常毒性標(biāo)準(zhǔn)，使用15批樣品進(jìn)行常規(guī)檢驗驗證，注射后動物基本上無異常反應(yīng)，供試品均能符合起草的異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)要求。

在進(jìn)行急性毒性測定時，供試液的配制均是以主藥細(xì)辛腦的量來配制，稀釋液采用與臨床用藥一致的5%或10%的葡萄糖注射液。小鼠在靜脈注射供試液后，主要表現(xiàn)為驚厥、小便失禁、全身歪倒、呼吸急促、匍匐少動、豎毛、死亡等，毒性較大，但各企業(yè)的產(chǎn)品毒性又有較大區(qū)別，或同一企業(yè)的不同劑型毒性有較大差別，可能是由于制劑添加的輔料多少不同而引起。細(xì)辛腦注射制劑，各個企業(yè)的生產(chǎn)工藝不盡相同，添加了較多的賦形劑，主要包括吐溫80、乙醇、丙二醇、聚乙二醇400、苯甲醇等，但不排除主藥細(xì)辛腦產(chǎn)生了協(xié)同毒性作用［2］。本品毒性較大，建立異常毒性檢查標(biāo)準(zhǔn)，既可以通過標(biāo)準(zhǔn)來檢查異常毒性物質(zhì)是否超標(biāo)，也可考查產(chǎn)品中輔料是否過量添加，因為添加過量的輔料也可能引起毒性增加。

起草標(biāo)準(zhǔn)時，對異常毒性檢查的供試液進(jìn)行溶血與凝聚考查，是為了考查供試液是否會引起強烈的溶血與凝聚作用，以避免異常毒性檢查時動物發(fā)生的反應(yīng)是由于供試液有較強的溶血與凝聚作用引起。

本文對所有企業(yè)的名稱均使用代號處理。

參考文獻(xiàn)：

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［5］ 中國藥典.二部［S］.2010：附錄212－215.

［6］ 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（2010年版）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：310 －325.

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［8］ 張良，蒲旭峰，張德波.注射用頭孢地嗪鈉生物安全性檢查標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，9（3）：281－285.

〔修回日期〕2015－01－05

Study on abnormal toxicity test standard of asarone injection preparation

DENG Sha，ZHANG De-bo，LUO Jie，ZHENG Jiao-jiao，ZHENG Ping，PU Xu-feng
（ChengDu Institutes for Food and Drug Control，ChengDu 610045，China）

【Abstract】Objective To measure the lethal dosage values（LD50）of i. v. asarone injection for mice and to establish a standard for abnormal toxicity test of asarone injection to potentially reduce the occurrence of adverse drug reaction. Methods To obtain the LD50value，a weighted linear probit regression method（Bliss method）is employed. The limit of abnormal toxicity test is determined according to Appendix XI C in its 2010 edition of the Chinese pharmacopoeia. Results It is found that the LD50of intravenously asarone injection in mice ranges from 51. 9 to 153. 1 mg/ kg. The abnormal toxicity test should be added as an additional item in the standard. Conclusions Based on analyses in this study，an appropriate limit of abnormal toxicity test is 15 mg/ kg，which is also in line with current medical standard in China.

【Key words】Asarone；Abnormal toxicity；LD50；Limit value；Standard

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0035-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 008

［基金項目］中央補助地方經(jīng)費項目（食藥監(jiān)辦藥化監(jiān)［2014］61號）。

［作者簡介］鄧莎（1982－），女，碩士生，主管藥師，專業(yè)：藥理學(xué)。E-mail：ds88884@ sina. com。