高采平，韓盛璽

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610072)

幽門螺桿菌的細胞內(nèi)感染及機制研究進展

高采平，韓盛璽△

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610072)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一種主要定植于人胃黏膜的革蘭氏陰性菌，與多種胃內(nèi)外疾病密切相關(guān)，曾被認為是一種胞外致病菌，然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)H. pylori可以進入細胞內(nèi)存活、復(fù)制，可能為兼性胞內(nèi)菌。而且，細胞內(nèi)感染可能在H. pylori致病及耐藥方面起重要作用。本文回顧了H. pylori的細胞內(nèi)感染及機制研究進展。

幽門螺桿菌；細胞外感染；細胞內(nèi)感染；自噬異常

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一種主要定植在人類胃黏膜小凹中、并能夠引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌以及胃黏膜組織相關(guān)淋巴瘤(MALT淋巴瘤)等嚴(yán)重病變的螺旋狀細菌。1983年，澳大利亞科學(xué)家Warren和Marshall首次從人類胃黏膜組織中分離培養(yǎng)出H. pylori[1]；1994年，H. pylori被世界衛(wèi)生組織定義為Ⅰ類致癌原；2015年，《全球幽門螺桿菌京都共識意見》再次強調(diào)根除H. pylori感染可以預(yù)防胃癌發(fā)生[2]。H. pylori主要定植于人類胃小凹中、部分游離存在于胃黏液層或粘附在胃黏膜細胞表面，通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)將毒力因子注入胃黏膜細胞內(nèi)，曾經(jīng)被認為是一種胞外致病菌。但是，越來越多的研究提示H. pylori可以進入上皮細胞、吞噬細胞內(nèi)存活，可能為兼性胞內(nèi)菌[3～7]。然而，關(guān)于H. pylori是否與腸道細菌一樣，如志賀氏桿菌、傷寒沙門氏菌等[8]，主要分布在細胞外和細胞表面，特定條件下進入細胞內(nèi)引起持續(xù)性或復(fù)發(fā)性感染，目前尚不完全清楚?，F(xiàn)就H. pylori的細胞內(nèi)感染及相關(guān)機制研究進展綜述如下。

1 人體胃黏膜組織中，細胞內(nèi)H. pylori感染

H. pylori感染的人體胃黏膜活檢組織，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胃竇黏膜組織中的H. pylori主要分布在細胞連接處或粘附在細胞表面，但部分細胞內(nèi)也可見到完整的H. pylori。Wyle等首先在透射電鏡下觀察到胃黏膜上皮細胞、壁細胞、主細胞內(nèi)見到完整的H. pylori[9]。Bode和Ko等分別在腸化上皮細胞、基底細胞中也見到完成的H. pylori[10，11]。Noach等報道在電鏡下觀察到的231個H. pylori中，約71%的H. pylori游離存在于胃黏液中，約3%的H. pylori存在于上皮細胞內(nèi)，其余的細菌粘附在細胞表面或部分被細胞膜包裹[12]；被細胞膜包裹的H. pylori可能進入細胞內(nèi)。Ko和Chan等發(fā)現(xiàn)在胃黏膜活檢標(biāo)本，有2%～6%的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有完整的H. pylori存在[11，13]。另外，H. pylori還可存在于腺體的底部和壁細胞的微管中[14]。

電鏡下觀察到細胞內(nèi)H. pylori感染可能與H. pylori的根除療效有關(guān)。沒有細胞內(nèi)H. pylor感染的患者根除率明顯高于胃黏膜底部有細菌感染或有細胞內(nèi)細菌感染者[15]。盡管不同研究者均發(fā)現(xiàn)胃黏膜細胞內(nèi)存在完整的H. pylori，但目前尚無證據(jù)表明人體組織中細胞內(nèi)H. pylori是存活、復(fù)制的。

2 體外培養(yǎng)細胞中，細胞內(nèi)H. pylori感染

在腸道細菌中，如志賀氏桿菌、傷寒沙門氏菌等，可以侵入腸黏膜上皮細胞內(nèi)存活和繁殖，引起持續(xù)性或復(fù)發(fā)性感染[8]。大量研究觀察了H. pylori是否與腸桿菌一樣，可侵入細胞內(nèi)存活并繁殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的上皮細胞、巨噬細胞、小鼠骨髓源性樹突狀細胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體中存在活的H. pylori。在巨噬細胞中，Wang等觀察到H. pylori寄居于U937或THP-1細胞內(nèi)雙層膜樣結(jié)構(gòu)的自噬小體中，而且自噬小體的形成與H. pylori在細胞內(nèi)的存活和復(fù)制密切相關(guān)，采用自噬激活劑雷帕霉素或抑制劑3-甲基腺嘌呤調(diào)控細胞自噬后，H. pylori在細胞內(nèi)的復(fù)制水平受到影響[16]。Deen等采用免疫熒光共聚焦顯微鏡、投射電鏡等觀察到H. pylori被體外培養(yǎng)的THP-1、RAW264.7細胞吞噬進入細胞內(nèi)，85%～95%的胞內(nèi)細菌進入吞噬體內(nèi)、小部分細菌游離在胞質(zhì)中或存在于自噬體中[17]。在胃黏膜上皮來源細胞中，Amieva等采用微分干涉差光顯微鏡和免疫熒光顯微鏡在AGS細胞感染H. pylori后2～7小時均見到完整的細胞內(nèi)細菌，采用H. pylori抗體染色證實為H. pylori；進一步動態(tài)觀察細胞內(nèi)H. pylori的運動軌跡，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)空泡中H. pylori可以從細胞內(nèi)運動到細胞外[4]。

很多細菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物慶大霉素敏感，但慶大霉素不能滲透進入細胞內(nèi)。因此，體外實驗中慶大霉素常用來清除細胞外和細胞表面感染敏感細菌，但對細胞感染內(nèi)細菌無效。在體外培養(yǎng)的上皮細胞(AGS、HEK293)，巨噬細胞(THP-1、U937)中采用慶大霉素清除細胞外感染及粘附的H. pylori后，將細胞裂解進行H. pylori培養(yǎng)，仍能檢測到細胞內(nèi)H. pylori生長[5，16，18]。H. pylori在細胞內(nèi)可以存活72小時甚至更長時間[5，16，18]。體外培養(yǎng)的Hep-2細胞中球形變的H. pylori可以在胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)幾代后存活[19]。

3 細胞內(nèi)H. pylori感染的機制

自噬異常是促進病原菌侵入細胞內(nèi)存活、復(fù)制的的主要原因。在秀麗線蟲中自噬相關(guān)基因失活會引起鼠傷寒沙門氏菌在細胞內(nèi)的復(fù)制[20]；在小鼠中干擾細菌感染自噬相關(guān)途徑將促進志賀氏桿菌在細胞內(nèi)的復(fù)制[21]。自噬是細胞內(nèi)的物質(zhì)成分利用溶酶體被降解過程的統(tǒng)稱，是真核細胞所特有的生命現(xiàn)象，是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器的共同機制。

H. pylori感染也引起細胞自噬異常。H. pylori可能通過胞飲、酪氨酸激酶活化、肌動蛋白聚合、受體介導(dǎo)的胞吞作用侵入細胞內(nèi)。人體胃黏膜組織中，細胞內(nèi)H. pylori存在于空泡中，與自噬相關(guān)的溶酶體樣結(jié)構(gòu)相鄰[10]。體外培養(yǎng)細胞中，Terebiznik等[19]首先報道H. pylori感染AGS細胞后可誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬，即在投射電鏡下觀察到自噬小體存在，自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，以及熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白標(biāo)記的LC3(GFP-LC3)向自噬小體聚集。該過程依賴宿主的自噬蛋白Atg5 和Atg12，Atg5 和Atg12 敲除的細胞在感染H. pylori后，出現(xiàn)GFP-LC3 熒光斑點的數(shù)量減少和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變減少[19]。而且，在自噬缺陷的細胞模型中，細胞內(nèi)H. pylori存活數(shù)量更多[22]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)H. pylori感染后，宿主細胞的自噬功能異常是H. pylori在細胞內(nèi)存活的主要原因。H. pylori侵入細胞時，數(shù)十個與自噬囊泡形成、延展、成熟相關(guān)的分子表達異常，包括AKT1、MBRA1、APP、ATG16L1、ATG16L2、ATG3、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、BAD、BAX、BCL2L1、BECN1等表達降低，而CTSS、GABARAPL1、MAP1LC3B、NFKB1、SQSTM1、TNF的表達增加[23]。H. pylori感染后，微RNA30B表達上調(diào)導(dǎo)致其靶基因自噬相關(guān)蛋白Atg12和BECN1表達下降，誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬[18]。細菌脂多糖刺激細胞引起B(yǎng)ECN1蛋白泛素化，使BECN1與BCL2解離從而誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生自噬[24]，延遲吞噬后同型吞噬體融合[25]，阻止巨噬細胞內(nèi)吞噬體的成熟[26]。H. pylori感染ATG16L1型宿主后，ATG16L1與NOD2受體相互作用募集自噬相關(guān)蛋白包繞入侵的細菌形成自噬小體、肽聚糖脫乙酰酶通過調(diào)節(jié)細胞NOD2受體通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬小體中缺乏降解底物的組織蛋白酶D，使得功能缺陷的自噬小體不斷蓄積，并成為H. pylori在細胞內(nèi)存活和復(fù)制的庇護所(圖1)[22]。H. pylori進入上皮細胞或巨噬細胞后可能出現(xiàn)三種結(jié)局:① 誘導(dǎo)細胞自噬，并在自噬體中被降解[5，16，19]；②下調(diào)自噬相關(guān)蛋白表達，逃逸自噬[17，18，22，25]；③ 利用自噬體為自身復(fù)制提供庇護所[4，5，7，16]。

圖1 H. pylori感染后進入細胞內(nèi)存活的可能機制[21]

體外研究顯示vacA基因缺陷的突變型菌株及其無菌培養(yǎng)上清感染細胞后均不能形成自噬小體，提示VacA對H. pylori感染誘導(dǎo)的細胞自噬是必不可少的，而細菌的其他毒力因子如細胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、尿素酶，則無明顯影響[21]。目前發(fā)現(xiàn)，影響H. pylori侵入細胞內(nèi)存活的因素還包括體外培養(yǎng)細胞液中肽牛血清的濃度、宿主基因ATG16L1型等位基因突變可能促進H. pylori進入細胞[22]。

4 小結(jié)

H. pylori感染的患者和體外培養(yǎng)細胞中均發(fā)現(xiàn)H. pylori的細胞內(nèi)感染，提示H. pylori可能為兼性胞內(nèi)感染細菌。H. pylori在細胞內(nèi)存活和復(fù)制可能是機體免疫反應(yīng)和抗菌素?zé)o法將其徹底清除的原因之一，然而其確切機制仍不完全清楚。我國是H. pylori感染和胃癌的高發(fā)地區(qū)。盡管治療H. pylori感染的方案越來越復(fù)雜，療程也從7天延長到14天，即使是敏感抗菌素也可能出現(xiàn)治療失敗。細胞內(nèi)感染可能在H. pylori感染所致的胃癌發(fā)生以及根除治療失敗中起重要作用，有待進一步深入研究。

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Advances in intracellular infection of helicobacter pylori

GAO Cai-ping，HAN Sheng-xi

國家自然科學(xué)基金青年項目(編號:81001083/H1617))

R573.6

B

1672-6170(2016)02-0171-03

2015-12-18；

2016-01-10)

△通訊作者