馮春燕，宋曉暉，仇松寅，王淑娟，王彩霞，張永寧，鄧俊花，吳紹強，林祥梅（. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 0009；. 中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京004；. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島660）

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非洲豬瘟病毒p54蛋白的表達及單抗制備

馮春燕1，宋曉暉2，仇松寅1，王淑娟3，王彩霞1，張永寧1，鄧俊花1，吳紹強1，林祥梅1
（1. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100029；2. 中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京100142；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

摘 要：為制備非洲豬瘟病毒p54蛋白的單克隆抗體，本研究擴增p54蛋白的胞外區(qū)編碼基因，分別克隆到pET30a和pGEX-6p-1中，構(gòu)建了p54-pET30a和p54-pGEX-6p-1重組質(zhì)粒；將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，表達C末端帶6個His、N端帶有GST的p54重組蛋白；利用親和層析的方法，富集和純化帶His標(biāo)簽的p54蛋白；以帶His標(biāo)簽的p54蛋白為抗原，免疫BALB/C小鼠，制備單克隆抗體；以帶有 GST標(biāo)簽的p54蛋白為抗原，對制備的單抗進行特異性驗證。結(jié)果顯示：大腸桿菌能高效表達帶His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽的非洲豬瘟p54蛋白；His標(biāo)簽的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后，得到了3株單克隆抗體；Western blot結(jié)果表明，3株單克隆抗體能與帶有GST標(biāo)簽的p54蛋白相互反應(yīng)。本研究成功制備了p54的單克隆抗體，為進一步開展非洲豬瘟ELISA、Western blot和細胞免疫熒光檢測技術(shù)的開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；p54蛋白；體外表達；單克隆抗體

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的，一種豬的急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，可以跨境傳播[1]。ASFV為DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬。病毒具有二十面體結(jié)構(gòu)，主要由4層組成：中央核仁、核衣殼、內(nèi)層囊膜和二十面體的病毒衣殼。病毒衣殼還包裹一層來源于宿主的外囊膜。進一步的分子生物學(xué)研究顯示，ASFV基因組全長170 101 bp核苷酸，含有151～167個ORFs。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白有54個，包括p72、p54、p30等[2-3]。

p54蛋白由ASFV的E183L基因編碼，全長含有552個堿基，預(yù)測分子量大小為19.9 bp。p54蛋白在病毒的復(fù)制過程中起著重要作用，能夠引起宿主細胞的凋亡，也是病毒包裝必需的蛋白。ASFV感染細胞后，p54蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處短暫表達，在病毒復(fù)制過程中通過其獨特的半胱氨酸形成以二硫鍵連接的同源二聚體，與宿主的細胞質(zhì)動力蛋白結(jié)合，介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)運[6]。p54蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)在病毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體時起十分重要的作用。p54蛋白也是血清學(xué)診斷和免疫學(xué)研究中備受關(guān)注的蛋白。研究表明，以p54蛋白為檢測抗原建立的檢測方法具有高度敏感性和特異性[7]。

目前在我國還未發(fā)現(xiàn)ASF感染病例。因缺乏有效的疫苗及防控措施，使得ASF精準(zhǔn)檢測方法的研究具有重要的意義。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達帶有His標(biāo)簽的非洲豬瘟p54蛋白，利用純化后的p54蛋白來制備單克隆抗體。利用帶有GST標(biāo)簽的p54蛋白對抗體特異性進行驗證。本研究將為建立ASF的ELISA方法、細胞免疫熒光檢測方法和Western blot方法做好基礎(chǔ)準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1酶類、試劑和引物

NdeI、Bam HI、Xho I和PCR相關(guān)試劑等，購自大連寶生物工程有限公司；蛋白質(zhì)marker、IPTG和Western blot 發(fā)光液等，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；His單抗及辣根酶標(biāo)記的小鼠IgG二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程股份有限北京分公司合成。測序由北京華大基因研究中心有限公司完成。

1.2非洲豬瘟p54表達載體的構(gòu)建

參考NCBI中ASFV的E75（GenBank：FN557520.1）毒株的p54基因序列，在大連寶生物公司合成p54基因后，直接連接至載體pBR322上，作為后續(xù)p54基因擴增的模板。將表達載體pET30a及pGEX-6p-1轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細菌，用LB液體培養(yǎng)基大量培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒作為克隆載體。在p54基因兩端分別設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶的位點，引物序列如表1所示。

表1　p54 克隆的引物序列

利用設(shè)計的引物擴增目標(biāo)p54片段，將提取的載體（pET30a及pGEX-6p-1質(zhì)粒）和p54片段分別用相應(yīng)的酶進行雙酶切后，使用DNA膠純化試劑盒純化酶切的p54基因片段和載體片段。在連接酶作用下，將酶切的p54基因片段和載體片段進行連接，于4℃過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細菌，挑取單菌落，提取重組質(zhì)粒進行測序分析。構(gòu)建的陽性質(zhì)粒分別為p54-pET30a 和p54-pGEX-6p-1。

1.3蛋白的表達

將p54-pET30a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后取過夜培養(yǎng)物。新鮮的LB培養(yǎng)液以1:100（體積比）的比例重新接種，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，然后加入1mM的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)8 h，收菌。進行SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯亮藍染色，觀察表達結(jié)果。

將p54-pGEX-6p-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 （DE3）感受態(tài)中，用上述同樣的方法37 ℃或者16 ℃進行誘導(dǎo)表達，收菌，進行SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯亮藍染色，觀察表達結(jié)果。

1.4蛋白的純化

利用Qiagen的Ni-NTA Argarose（cat.30210）使用說明進行p54蛋白的純化。簡要流程為：收集大量表達帶His標(biāo)簽的p54的菌液，用無菌的PBS洗滌2遍，然后利用超聲破碎儀進行破碎，高速離心，收集細胞上清。將上清與預(yù)先處理好的Ni-NTA Argarose在4 ℃結(jié)合過夜，去掉流穿液，用PBS洗滌，去除雜蛋白。利用含有10 mM、20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、150 mM和200 mM的含有咪唑的洗滌液，對Ni-NTAArgarose進行洗滌，收集洗脫液，進行SDS-PAGE凝膠電泳，觀察純化結(jié)果。將純度較高的p54蛋白合并濃縮。

1.5單克隆抗體的制備

將純化的帶His標(biāo)簽的p54蛋白50 ug加佐劑，免疫BALB/C小鼠，進行單克隆抗體的制備。3周后重復(fù)免疫一次，再3周后最后一次加強免疫。3天后，取脾細胞，進行融合篩選。包被p54蛋白，利用ELISA方法進行雜交瘤細胞的篩選。對篩選陽性的細胞擴繁，取上清，然后進行進一步的驗證。

1.6單克隆抗體的驗證

將含表達p54蛋白（GST標(biāo)簽）的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的PBST于4 ℃封閉過夜；用PBST洗滌膜3次后加入一抗（細胞上清），于4 ℃緩慢搖動過夜；再用PBST洗滌膜3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5 000稀釋），室溫結(jié)合1 h；用PBST洗滌膜3次，加入顯色試劑反應(yīng)，壓片并顯影。

1.7p54蛋白的抗原表位的預(yù)測

將表達的p54蛋白的序列輸入到蛋白質(zhì)表位預(yù)測網(wǎng)站進行表位預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/ BepiPred/）。將同樣的序列輸入二級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/），整理預(yù)測結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1P54蛋白的克隆及質(zhì)粒鑒定

對P54蛋白的全長進行跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果如圖所示（圖1A）。全長蛋白的31位至54位為一段跨膜區(qū)。由于帶跨膜區(qū)的蛋白在大腸桿菌中很難表達，因此本研究對p54蛋白進行截短，去掉蛋白的跨膜序列（圖1B），僅表達p54基因的162～549位的基因序列。對這一段序列進行PCR擴增，然后用限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別連接到pET30a 和pGEX-6p-1中。陽性質(zhì)粒經(jīng)測序表明，p54基因162位到549位的核苷酸序列成功連接到表達載體pET30a和pGEX-6p-1中，且p54-pET30a表達的p54蛋白C末端增加了6個His氨基酸，便于蛋白的純化。

2.2p54蛋白的表達及純化

圖1　p54的跨膜區(qū)預(yù)測及表達片段示意

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，16℃條件下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達情況圖2 所示。結(jié)果表明，與不含重組質(zhì)粒的BL21菌液對照相比，含有質(zhì)粒的BL21菌液在25 kd的蛋白marker下有一條明顯的條帶。該條帶很可能為帶有His標(biāo)簽的目的條帶。對菌種進行擴大培養(yǎng)，利用Ni-NTA agrose對帶標(biāo)簽的蛋白進行純化，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，咪唑濃度在40 mM到100 mM時，得到目標(biāo)大小的蛋白純度較高。

圖2　p54蛋白的表達

2.3p54蛋白的驗證

為了進一步驗證所得到的蛋白為帶His標(biāo)簽的p54蛋白，本研究利用His單抗為一抗進行Western blot驗證，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，在15～25 kd的大小，有非常清晰的帶His標(biāo)簽的蛋白出現(xiàn)。結(jié)合質(zhì)粒的測序結(jié)果，可以證實該蛋白為p54蛋白。

圖3　p54蛋白的純化

圖4　p54蛋白His 單抗的Western blot驗證

2.4p54蛋白單克隆抗體的驗證

為了驗證制備的單抗，本研究構(gòu)建了p54-pGEX6p-1表達載體，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21表達菌株進行蛋白表達。結(jié)果如圖5A所示，在40～50 kd有明顯的表達帶，與p54-GST融合蛋白的大小相符。將表達的p54-GST蛋白與制備的上述單克隆抗體細胞上清（分別命名為1號、3號和4號）進行Western blot雜交。結(jié)果表明（圖5B），單克隆抗體的細胞上清能與3株細胞上清相互反應(yīng)，大小在40～50 kd之間，與P54-GST融合蛋白的大小相符。2.5 p54蛋白質(zhì)B細胞表位及二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

圖5　單克隆抗體的驗證

對p54的抗原性預(yù)測表明，p54具有很強的抗原性。對B細胞識別表位的預(yù)測表明，表達的130個氨基酸中，有101個氨基酸可能參與了B細胞表位的形成。這101個氨基酸分別分布在4個不同的區(qū)段。對這些區(qū)段進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了在第一個區(qū)段為螺旋結(jié)構(gòu)外，其它區(qū)段的二級結(jié)構(gòu)均為無規(guī)則卷曲（表2）。

3　討論

ASFV可以感染各年齡段的家豬和野豬。缺乏有效的疫苗是目前防治該疫病面臨的最大問題。有研究利用細胞傳代獲得致弱病毒作為疫苗候選，并在豬中進行攻毒試驗，結(jié)果表明該致弱病毒只能對同源病毒的感染起保護作用，對異源病毒的保護性有限。有研究將病毒的9GL基因進行敲除，結(jié)果表明敲除了該基因的病毒能夠復(fù)制并具有很好的保護效應(yīng)，但該研究結(jié)果尚未應(yīng)用[8]。在這種形勢下，建立精準(zhǔn)的檢測方法是防止該病傳入我國的重要手段之一。而制備高特異性的單克隆抗體對建立ASF血清學(xué)檢測方法具有重要意義。

表2　p54蛋白的B細胞表位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

ASFV屬于DNA病毒，目前對其分子生物學(xué)的研究并不深入。研究表明，p72、p30和p54是重要的抗原蛋白，都能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生抗體[9]。經(jīng)過跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖1A）及已有的報道，p54蛋白為跨膜蛋白，全長在大腸桿菌中無法表達。為了解決這一問題，本研究截取了p54的胞外段，即氨基酸N末端54位到C末端183位的氨基酸序列（圖1B），進行體外表達，并作為抗原進行單抗制備。根據(jù)已有報道，體外表達的可溶序列與感染的豬血清進行western blot反應(yīng)，結(jié)果證實這段體外表達的序列具有抗原性[10-11]。但是，ASF為外來病，目前國內(nèi)并沒有該病毒的陽性血清，因此無法利用陽性血清來驗證表達的蛋白是否為所需的重組蛋白。但由于重組蛋白含有His標(biāo)簽，對融合表達的p54 C末端的His標(biāo)簽進行檢測，結(jié)合蛋白的大小來判斷所純化的蛋白是否為p54蛋白（圖3）。

利用帶GST標(biāo)簽的p54對得到的單抗進行進一步篩選。研究結(jié)果顯示，本研究得到了3株特異性較好的單克隆抗體。由于利用Western blot方法進行抗體的特異性鑒定，因此可以斷定這些單抗可以識別p54蛋白的線性表位。這3株單抗是否識別同一表位，以及識別序列的具體信息將在今后的研究中進一步探索。

p54的生物信息學(xué)預(yù)測顯示，所表達的130個aa中，有101個aa參與了B細胞表位的形成。這些表位主要集中在4個區(qū)域內(nèi)（表2）。由于B細胞抗原表位的形成[12]有一些自身特點，如：（1）主要由抗原表面的親水性氨基酸殘基組成；由連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基組成。（2）B表位通常位于抗原分子的柔性區(qū)，具有可動性，這一特點有利于表位和抗體結(jié)合部位呈現(xiàn)最佳的結(jié)構(gòu)互補狀態(tài)，增強結(jié)合的親和力。據(jù)此推測，表位在2～4區(qū)域內(nèi)存在的可能性較大，這也為在未來的研究中進一步分析單抗的抗原表位提供了有用的線索。

綜上所述，本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了p54蛋白的保外區(qū)，獲得了p54蛋白的單克隆抗體。實驗結(jié)果為ASFV的western blot、ELISA及細胞免疫熒光等檢測方法的建立，疫苗研發(fā)以及ASFV分子生物學(xué)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Expression and Purifi cation of p54 Protein of Africa Swine Fever Disease and Production of Its Specifi c Monoclonal Antibodies

Feng Chunyan1，Song Xiaohui2，Qiu Songyin1，Wang Shujuan3，Wang Caixia1，Zhang Yongning1，Deng Junhua1，Wu Shaoqiang1，Lin Xiangmei1
（1. Chinese Academy of Inspection and Qurantine，Institute of Animal Quarantine，Beijing 100029；2.China Animal Disease Prevention and Control Center，Beijing 100142；3.China Animal Health and Epidemology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：This study was aimed to obtain the monoclonal antibodies of P54 protein of African swine fever virus（ASFV）. Firstly，the outer-membrane segment of p54 gene was amplifi ed. Then the segment was cloned into pET-30a plasmid and pGEX 6p-1 plasmid respectively. Plasmids were further transformed into BL21E.coli，which could express the soluble P54 protein. Using affi nity chromatography method，the p54 protein was further purifi ed and used for monoclonal antibodies production. Western blot was used to verify the monoclonal antibodies. As shown in the results， 25 kd recombined protein was expressed by E.coli system. Using His specifi c antibody，Western blot experiment proved that this recombined protein was target p54 protein with his tag. After immunizing the mouse with purifi ed P54 protein，three monoclonal antibodies were obtained. Western blot experiment proved that all three monoclonal antibodies could be reacted with GST-p54 fusion proteins. This study will pave the way for further development of detection methods for ASFV，including ELISA，Western blot and immune-fl uorescent assay.

Key words：africa swine fever virus；p54 protein；in vitro expression；monoclonal antibodies

中圖分類號：S855.3 文獻標(biāo)示碼：A

文章編號：1005-944X（2016）05-0080-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.025

基金項目：十二五科技支撐計劃（2013BAD12B01）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2015IK310）

通訊作者：吳紹強，林祥梅