陳忠杰，李利紅，李存法，胡　燕（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州450011）

?

槐花多糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的試驗

陳忠杰，李利紅，李存法，胡燕
（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州450011）

摘要：以槐花為試材，研究槐花多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。將槐花多糖用生理鹽水配制成一定濃度的溶液，以腹腔注射的方法作用于小鼠，測定小鼠外周血和脾臟淋巴細胞增殖、腹腔巨噬細胞活性和免疫器官指數(shù)等指標的變化。結(jié)果1.0 mL/d的槐花多糖注射量可以顯著促進小鼠外周血和脾臟淋巴細胞的增殖，提高小鼠巨噬細胞活性，并促進小鼠免疫器官的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：槐花；多糖；免疫調(diào)節(jié)

槐花（Sophora japonica）又名槐蕊，為豆科植物槐（Sophora japonica L）的干燥花朵及花蕾，前者習(xí)稱為“槐花”，后者習(xí)稱為“槐米”?；被ㄖ泻胸S富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、多種維生素，還含有刀豆酸、槐花二醇、蕓香苷、三萜皂苷、白樺脂醇、葡萄糖醛酸、蘆丁等，使其具有抗氧化性、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、降壓、擴冠等作用、降血脂作用、抑制醛糖還原酶作用、致突變作用等很多功能特性［1］。目前，對槐花的研究主要集中在黃酮類化合物上，把槐花作為提取蘆丁的主要原料［2］?；被ǖ乃幚碜饔枚鄻?，化學(xué)成分復(fù)雜。為合理開發(fā)利用槐花資源，必須對槐花進行全面的研究［3］。多糖是自然界和生物體中廣泛存在的物質(zhì)，它是生物體內(nèi)一類重要的大分子，具有提高免疫能力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等功能，是藥理學(xué)研究的新熱點。目前，對槐花多糖功能作用的研究較少，只涉及到其抗氧化［4］和抑菌功能［4］。本實驗旨在研究槐花多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為槐花作為免疫增強藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料昆明種純系小鼠，5周齡，由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物實驗中心提供。

以干洋槐花為材料，用水提法提取槐花多糖。提取工藝為：干槐花→粉碎→過孔徑為0.425 mm篩→乙醚脫脂→干燥后得脫脂樣品→取脫脂樣品，加適量蒸餾水→80℃浸提6 h→離心（4 000 r/min離心15 min）→沉淀加蒸餾水進行第2次提取（提取4次）→合并4次離心上清液→減壓濃縮→濃縮液中加入乙醇，使其體積分數(shù)為80%→沉淀依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌→干燥，得粗多糖樣品［3］。

1.2主要試劑淋巴細胞分離液，上海泛柯實業(yè)有限公司生產(chǎn)；噻唑藍（MTT），上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；二甲亞砜（DMSO），成都貝斯特試劑有限公司生產(chǎn)；青霉素、鏈霉素、小牛血清、刀豆蛋白A （ConA）和脂多糖（LPS），均由上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗設(shè)計用生理鹽水將槐花多糖樣品配制成1 mg/mL的溶液供使用。取小鼠48只，隨機均分為4組。其中三組為試驗組，一組為對照組。試驗Ⅰ組均每天分別腹腔注射槐花多糖每只0.5 mL，試驗Ⅱ組均每天分別腹腔注射槐花多糖每只1 mL，試驗Ⅲ組均每天分別腹腔注射槐花多糖每只1.5 mL，對照組Ⅳ組均每天分別腹腔注射生理鹽水每只1 mL，連續(xù)7 d。其他飼養(yǎng)條件均按正常進行。在最后一次注射24 h后，每組隨機抽取6只小鼠腹腔注射8%蛋白胨溶液2 mL，再24 h后進行眼眶采血，用500 IU/mL的肝素抗凝，隨后加入等量的D-Hank′s液，測定外周血淋巴細胞的增值。隨后快速宰殺小鼠，腹腔注射經(jīng)滅菌的D-Hank′s液8 mL，收集腹腔液，測定腹腔巨噬細胞活性。最后采取脾臟，制備成單個細胞懸液，測定脾臟淋巴細胞的增值。每組所剩6只小鼠在最后一次注射24 h后，測定免疫器官指數(shù)。

1.4檢測指標和方法

1.4.1淋巴細胞增殖測定采用MTT比色法。取上述待測樣本，加入淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。分別加入96孔培養(yǎng)板，加入適量ConA或LPS，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入DSMO 100 μL溶解細胞。10 min后于酶標儀中檢測A570值。

1.4.2巨噬細胞活性測定［5］取所收集的腹腔洗液于1 000 r/min離心10 min，用3 mL D-Hank′s液重懸，再離心洗滌1次；用1640完全培養(yǎng)液重懸，進行細胞計數(shù)（1×106/mL）。每組細胞懸液100 μL，重復(fù)4孔，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，換新鮮1 640培養(yǎng)液。繼續(xù)孵育2 h后，各孔加10 μL MTT，輕搖1 min，溫育4 h，加DMSO，震蕩30 s，測A570值。

1.4.3免疫器官指數(shù)測定將小鼠空腹稱重，用常規(guī)方法宰殺，分離出免疫器官脾臟和胸腺，并測定重量，計算出免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=器官重g/活體重g。

1.5數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行，試驗結(jié)果均以平均數(shù)±標準差表示，LSD法比較差異顯著值，以P＜0.05為顯著水平。

2　結(jié)果

2.1外周血淋巴細胞增殖變化槐花多糖對小鼠外周血淋巴細胞增殖的影響見表1。與對照組相比，試驗Ⅰ組（每只小鼠每天腹腔注射1 mg/mL的槐花多糖溶液0.5 mL），對ConA誘導(dǎo)和LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)作用均不明顯（P＞0.05）；試驗Ⅱ組（每只小鼠每天腹腔注射1 mg/mL的槐花多糖溶液1.0 mL），能顯著增強ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)（P＜0.05），但對LPS誘導(dǎo)的該反應(yīng)作用不明顯（P＞0.05）；試驗Ⅲ組（每只小鼠每天腹腔注射1mg/ml的槐花多糖溶液1.5 mL），對ConA誘導(dǎo)和LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)均有明顯作用（P＜0.05）。

表1　槐花多糖對小鼠外周血淋巴細胞增殖的影響

2.2脾臟淋巴細胞增殖變化槐花多糖對小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響見表2。與對照組相比，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組均對由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)作用不明顯（P＞0.05），但試驗Ⅲ組能顯著增強由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)（P＜0.05）；三個試驗組均對由LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)作用不明顯（P＞0.05）。

表2　槐花多糖對小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響

2.3腹腔巨噬細胞活性變化槐花多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用見表3。與對照組相比，試驗Ⅰ組對小鼠腹腔巨噬細胞活性的作用不明顯（P＞0.05），而試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組均能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的活性（P＜0.05）。

表3　槐花多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用

2.4免疫器官指數(shù)變化槐花多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響見表4。與對照組相比，試驗Ⅰ組對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響均不明顯（P＞0.05）；試驗Ⅱ組對脾臟指數(shù)影響不顯著（P＞0.05），但能顯著提高胸腺指數(shù)（P＜0.05）；試驗Ⅲ組能顯著提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

表4　槐花多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

3　小結(jié)與討論

淋巴細胞是白細胞的一種。由淋巴器官產(chǎn)生，是機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分。通常分為T淋巴細胞和B淋巴細胞。淋巴細胞的增殖能力經(jīng)常被用來評價機體免疫應(yīng)答水平?；被ǘ嗵怯写龠M小鼠淋巴細胞增殖的作用，但是不同的注射量影響不同。如1.0 mL/d的多糖注射量可以顯著增強由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖，但是0.5 mL/d的注射量作用不明顯。這說明足量的槐花多糖才能達到較好效果。而且同一注射量對由ConA誘導(dǎo)或由LPS誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖作用也不同。如1.0 mL/d的多糖注射量可以顯著增強由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細胞的增殖，但對由LPS誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖作用則不明顯。這可能是因為ConA誘導(dǎo)T細胞的增殖，而LPS誘導(dǎo)B細胞的增殖，所以槐花多糖中有效成分的作用機制不盡相同。

巨噬細胞也屬于免疫細胞，但是其屬于不繁殖細胞群，所以主要考查其活性?；被ǘ嗵强梢蕴岣呔奘杉毎钚?。試驗中，0.5 mL/d的注射量作用不明顯，但是1.0 mL/d和1.5 mL/d的注射量均能顯著增強巨噬細胞活性。同時，1.0 mL/d的注射量和1.5 mL/d的注射量對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響差異不大，說明多糖用量也不是越大越好。

免疫器官的發(fā)育狀況直接影響機體免疫應(yīng)答水平和抵抗外來微生物的感染和侵入的能力，其絕對重量和相對重量增加，說明機體的細胞免疫和體液免疫機能增強［6］。一定量的多糖注射量可以促進小鼠脾臟和胸腺的生長發(fā)育。但是不同注射量的影響不同。比如1.0 mL/d的注射量能顯著促進小鼠胸腺的生長，但是對脾臟影響不明顯。具體機理還有待進一步研究。

綜上所述，一定的槐花多糖注射量可以明顯增強小鼠外周血和脾臟淋巴細胞的增殖反應(yīng)，提高小鼠腹腔巨噬細胞的活性，促進小鼠免疫器官的生長發(fā)育，從而提高小鼠免疫力。因此值得進一步深入研究和探討，為槐花多糖作為免疫增強藥物的開發(fā)提供更多科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：

［1］馬利華.乳酸菌發(fā)酵對槐花營養(yǎng)及抗氧化性的影響［J］.食品工業(yè)科技，2009（4）：200-207.

［2］吳虹霽，蘭昌云，陳媛.槐花的研究進展［J］.廣東微量元素科學(xué)，2006，13（6）：1-6.

［3］王麗華，段玉峰，馬艷麗，等.槐花多糖的提取工藝及抗氧化活性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，36（8）：213-217.

［4］胡喜蘭，姜琴，尹福軍，等.正交實驗優(yōu)選槐花多糖的最佳提取工藝及抑菌活性研究［J］.食品科技，2012，37（4）：164-167.

［5］儲岳峰，李祥瑞，胡元亮.9種中藥成分對小鼠免疫細胞活性的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27（1）：97-100.

［6］楊小燕，林躍鑫，李焰.銀杏葉對肉雞生長性能免疫功能和血清生化指標的影響［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43（2）：37-39.

中圖分類號：R 282

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0115- 03

收稿日期：2014-09-29

作者簡介：陳忠杰（1978-），男，講師，碩士，從事生物制藥方面的研究，E-mail：chzhji@126.com