葉長虹　林　霖　褚以忞　吉　猛　曾　欣　林　勇&

第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院消化內科1(200003)　上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院內鏡室2

血清miR-192和miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應用價值*

葉長虹1#林霖1#褚以忞2#吉猛1曾欣1林勇1&

第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院消化內科1(200003)上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院內鏡室2

背景：早期診斷肝硬化并予早期干預可阻止病情進展，避免或延緩肝硬化失代償發(fā)生。篩選血清學無創(chuàng)標記物是肝硬化臨床診斷和評估研究的重要內容。目的：評價血清miR-192和miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應用價值。方法：通過文獻檢索和real-time PCR篩選驗證發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者血清中差異表達明顯的miRNAs——miR-192和miR-29a，以real-time PCR檢測兩者在120例肝硬化患者和76名健康對照者血清中的表達水平；二元logistic回歸建立兩者聯(lián)合檢測診斷肝硬化的數(shù)學模型，ROC曲線評估診斷效能。結果：肝硬化組血清miR-192表達水平顯著高于對照組，血清miR-29a表達水平則顯著低于對照組(P<0.001)。由兩者聯(lián)合檢測數(shù)學模型計算得到的風險評分診斷肝硬化的價值明顯優(yōu)于單一指標檢測[ROC曲線下面積(AUC)：0.968對0.887和0.933]，且優(yōu)于臨床常用肝硬化血清學無創(chuàng)診斷指標APRI、FIB-4和ARR(AUC： 0.796、0.793和0.571)。血清miR-192、miR-29a表達水平以及兩者聯(lián)合檢測的風險評分與肝硬化Child-Pugh分級顯著相關(P<0.05)。結論：miR-192、miR-29a以及兩者聯(lián)合檢測的風險評分可作為肝硬化無創(chuàng)診斷和評估新的血清分子標記物。

關鍵詞血清；生物學標記；肝硬化；無創(chuàng)診斷；miR-192；miR-29a

肝硬化是各種慢性肝病的終末期改變，可能誘發(fā)門靜脈高壓和肝功能衰竭，并導致各種并發(fā)癥[1]。目前，肝硬化在全球常見死因中居第14位，在發(fā)達國家中的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[2]。失代償期肝硬化病情進展迅速、預后差，且缺乏有效治療手段，而早期診斷肝硬化并予早期干預可阻止病情進展，避免或延緩肝硬化失代償發(fā)生[2]。肝活檢是肝硬化診斷的金標準，但有發(fā)生出血、肝臟損傷等嚴重并發(fā)癥的風險，并存在取樣以及檢查者誤差，應用受到一定限制[3]。因此，探索更為方便、有效、無創(chuàng)的臨床指標以代替肝活檢用于肝硬化的早期診斷成為相關領域的研究熱點。

微RNA(microRNAs, miRNAs)是一組由18～24個堿基組成的非蛋白質編碼小分子RNA，可作用于靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)，在轉錄后水平調控基因表達[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs不僅穩(wěn)定存在于組織細胞中，一些miRNAs在血清中亦有穩(wěn)定表達，并與腫瘤以及多種慢性疾病相關，可作為諸多疾病診斷、治療和預后評估的生物學標記物[5]。本研究通過文獻檢索和血清miRNAs檢測，篩選出在肝硬化患者血清中差異表達較明顯的miR-192和miR-29a并加以驗證，并進一步評價兩者在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應用價值。

資料與方法

一、文獻檢索和miRNAs篩選驗證

以 “miRNA”、“l(fā)iver cirrhosis”、“l(fā)iver fibrosis”等為關鍵詞檢索PubMed，以“微RNA”、“肝硬化”、“肝纖維化”等為關鍵詞組合檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，檢索年限為2000年1月—2014年6月，獲取有關肝硬化、肝纖維化患者血清差異表達miRNAs的文獻，篩選肝硬化相關候選miRNAs。

收集2011年7月—2011年10月上海長征醫(yī)院消化內科診治的20例肝硬化患者的血清樣本，用于候選miRNAs的篩選驗證，其中男性12例，女性8例，年齡42～69歲。肝硬化組入選標準：①年齡>18周歲，性別不限；②有肝功能受損和(或)門靜脈高壓的臨床表現(xiàn)，經(jīng)臨床、影像學或肝活檢確診為肝硬化。肝硬化組排除標準：①近1個月內發(fā)生各種感染、消化道出血；②確診或懷疑合并惡性腫瘤(含原發(fā)性肝細胞癌)，AFP≥20 ng/mL者須經(jīng)CT、MRI等影像學檢查排除肝臟腫瘤；③有嚴重血液系統(tǒng)疾病，如淋巴瘤、白血病等或結締組織?。虎苡忻黠@心、肺、腎臟疾?。虎軭IV或梅毒陽性；⑥妊娠或哺乳期女性。同期收集體檢中心20名健康志愿者的血清樣本作為對照組，其中男性12例，女性8例，年齡41～69歲。對照組入選標準：①年齡>18周歲，性別不限；②有完整病史資料和實驗室、輔助檢查結果。對照組排除標準：①各種急慢性肝病，包括肝功能指標異常、HBsAg或HBV DNA陽性、HCV抗體或HCV RNA陽性、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝??；②長期大量飲酒或近2周內大量飲酒；③同肝硬化組排除標準①～⑥。血清樣本采集過程符合倫理要求并獲得知情同意，所采集樣本以real-time PCR行miRNAs表達檢測(方法見下文)。

二、血清miR-192、miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應用

1. 一般資料：收集2012年1月—2014年11月上海長征醫(yī)院消化內科診治的肝硬化患者120例，其中男性62例，女性58例，年齡35～73歲。同期收集體檢中心76名健康志愿者作為對照組，其中男性36例，女性40例，年齡35～70歲。肝硬化組和對照組入選和排除標準同miRNAs篩選驗證步驟。采集兩組臨床資料，計算臨床常用肝硬化血清學無創(chuàng)診斷指標，包括AST/血小板比值指數(shù)(AST/PLT ratio index, APRI)、基于四因素的肝纖維化指數(shù)(fibrosis index based on the 4 factors, FIB-4)和AST/ALT比值(AST/ALT ratio, AAR)。血清樣本和臨床資料采集過程符合倫理要求并獲得知情同意。肝功能分級采用Child-Pugh分級，根據(jù)血清總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、白蛋白(albumin, ALB)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、腹水和肝性腦病情況，分為A、B、C三級。

2. Real-time PCR檢測miRNAs表達：取350 μL血清，加入內參cel-miR-238(2 μmol/L)1 μL(上海吉瑪制藥技術有限公司)，以mirVanaTMPARISTMRNA and Native Protein Purification Kit(AmbionTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)提取總RNA，95 ℃預熱洗脫液100 μL溶解，檢測質量后-80 ℃冰箱保存。

以PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TAKARA BIO INC.)行逆轉錄反應合成cDNA。5 μL逆轉錄體系中含3 μL總RNA、1 μL逆轉錄酶混合物、0.5 μL cel-miR-238逆轉錄引物、0.5 μL miR-192或miR-29a逆轉錄引物(表1)。反應條件：16 ℃ 30 min，30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

表1　miR-192、miR-29a和內參引物以及內參序列

采用Applied Biosystems 7900HT快速實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific Inc.)行real-time PCR，所用試劑盒為SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)。總反應體系10 μL，內含2×SYBR Green熒光混懸液5 μL、各miRNAs forward引物和通用reverse引物各0.2 μL(表1)、cDNA 0.8 μL、去RNA酶水3.8 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法計算目的miRNAs相對表達量。每一樣本設3個復孔，結果取均值。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、候選miRNAs的篩選驗證

應用所設定的關鍵詞檢索PubMed、中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，共得到有關肝硬化、肝纖維化患者血清差異表達miRNAs的文獻233篇，文獻中與肝硬化、肝纖維化相關的血清差異表達miRNAs主要包括miR-21、miR-122、miR-571、miR-155、miR-194、miR-29a、miR-370、miR-192、miR-652。設計針對上述9個候選miRNAs的引物序列，取用于候選miRNAs篩選驗證的肝硬化患者和對照者的血清樣本各20例，以real-time PCR進行檢測鑒定，結果顯示肝硬化組miR-192、miR-571表達明顯上調，miR-29a、miR-155、miR-652表達明顯下調，其中miR-192、miR-29a在兩組間表達差異較為明顯(圖1)。

肝硬化組與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖19個候選血清miRNAs在肝硬化組與對照組間的差異表達

二、血清miR-192、miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應用價值

1. 一般資料：肝硬化組和對照組一般資料見表2。肝硬化病因：乙型肝炎63例，丙型肝炎9例，自身免疫性肝炎8例，血吸蟲性肝病10例，酒精性15例，原發(fā)性膽汁性肝硬化8例，肝豆狀核變性2例，隱源性5例；肝硬化Child-Pugh分級：A級47例，B級39例，C級34例。與對照組相比，肝硬化組TBIL明顯升高，ALT、AST有所升高，ALB、PLT、纖維蛋白原(FIB)下降，PT延長，國際標準化比值(INR)增高，APRI、FIB-4值分別為1.710±0.162和6.345±0.484，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組間凝血酶時間(TT)、AAR值無明顯差異(P>0.05)。

表2　肝硬化組和對照組一般資料比較

2. 血清miR-192、miR-29a表達水平：real-time PCR檢測結果顯示，肝硬化組血清miR-192表達水平顯著高于對照組，約為對照組的3.39倍(P<0.001)(圖2A)，血清miR-29a表達水平則顯著低于對照組，約為對照組的16.9%(P<0.001)(圖2B)。

除乙型肝炎外，本組由其他病因導致的肝硬化例數(shù)偏少，為明確血清miR-192、miR-29a表達變化是否與肝硬化病因有關，本研究進一步比較了兩者在乙型肝炎和非乙型肝炎肝硬化組間的表達情況，結果顯示兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

3. 血清miR-192、miR-29a診斷效能分析：ROC曲線分析顯示，以1.502為界值，血清miR-192診斷肝硬化的敏感性為84.17%，特異性為86.84%，ROC曲線下面積(AUC)為0.887(圖4A)；以0.287為界值，血清miR-29a診斷肝硬化的敏感性為89.17%，特異性為86.84%，AUC為0.933(圖4B)，兩者對肝硬化均有較高的診斷價值。

采用二元logistic回歸推導出血清miR-192和miR-29a聯(lián)合檢測診斷肝硬化的新數(shù)學模型：風險評分=1.978-11.320×miR-29a+1.183×miR-192。ROC曲線分析顯示，以1.431為界值，風險評分>1.431診斷肝硬化的敏感性為87.50%，特異性為97.37%，AUC為0.968(圖4C)，診斷價值明顯優(yōu)于單一指標檢測，尤其是在診斷特異性方面。APRI、FIB-4、AAR三項臨床常用血清學無創(chuàng)診斷指標診斷肝硬化的AUC分別為0.796、0.793和0.571(圖4D、4E、4F)，診斷價值均低于血清miR-192、miR-29a兩者單獨或聯(lián)合檢測(表3)。

4. 血清miR-192、miR-29a與肝硬化嚴重程度的相關性：Spearman秩相關系數(shù)分析顯示，血清miR-192、miR-29a表達水平以及兩者聯(lián)合檢測的風險評分與肝硬化Child-Pugh分級顯著相關(miR-192：P=0.021，rs=0.211；miR-29a：P=0.004，rs=-0.259；聯(lián)合檢測風險評分：P=0.009，rs=0.238)(圖5)。

圖2　血清miR-192、miR-29a在肝硬化組與對照組間的差異表達

圖3　血清miR-192、miR-29a在乙型肝炎與非乙型肝炎肝硬化組間的差異表達

圖4　不同血清學無創(chuàng)指標診斷肝硬化AUC比較

圖5　血清miR-192、miR-29a表達水平以及兩者聯(lián)合檢測風險評分與肝硬化Child-Pugh分級的相關性

討論

近年肝硬化發(fā)病率逐年升高，嚴重危害人類健康。肝硬化的早期診斷和評估是臨床工作中的難點，目前尚缺乏特異性、敏感性俱佳的血清學無創(chuàng)診斷方法，篩選血清學無創(chuàng)標記物是肝硬化臨床診斷和評估研究的重要內容。晚近研究表明，多種纖維化疾病患者外周血中存在穩(wěn)定表達的miRNAs，篩選并鑒定出一個或數(shù)個在肝纖維化/肝硬化患者血清中特異且穩(wěn)定表達的miRNA作為無創(chuàng)生物學標記物具有很高的臨床應用價值。然而目前血清miRNAs檢測方法尚有待改進，特別是缺乏穩(wěn)定、可靠的內參照物用于校準血清miRNAs檢測值。既往研究中，RNU6B(U6)常被用作血清miRNAs real-time PCR檢測的內參照物，但其血清表達水平個體差異較大且在肝纖維化患者中常較健康對照者顯著下調，并不適用于人肝硬化相關血清miRNAs檢測值的校準[6]。為建立準確的參照標準，多數(shù)研究者建議插入外源性RNA(spiked-in RNA)[7-9]。本研究于提取總RNA前在待測血清樣本中加入非人類同源的人工合成秀麗線蟲cel-miR-238作為血清miRNAs檢測的內參照物[10-11]，前期實驗結果顯示加入的外源性cel-miR-238在個體間表達穩(wěn)定，是相對理想的內參照物，可明顯提高血清miRNAs real-time PCR檢測的準確性。

miR-192和miR-29均為與纖維化明顯相關的miRNA，miR-29尚與多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、結直腸癌等關系密切，起抑癌基因作用。研究表明，在CCl4或膽總管結扎誘導的肝纖維化模型中，miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c)表達均顯著下調；在小鼠肝星狀細胞(HSCs)中過表達miR-29可抑制HSCs活化及其細胞外基質蛋白表達[12-14]。關于miR-192在肝纖維化中作用的研究不多，但其參與腎纖維化進程已得到證實。研究發(fā)現(xiàn)miR-192可通過作用于E-box抑制劑Zeb1/2以及調控其他腎臟miRNAs增加膠原基因表達；抑制糖尿病小鼠腎臟miR-192可上調Zeb1/2，從而抑制轉化生長因子-β(TGF-β)、纖維連接蛋白和膠原基因表達，減少膠原合成，阻止腎纖維化進程[15-17]。

本研究結果證實，肝硬化患者的血清miR-192、miR-29a表達水平與健康對照者相比差異顯著，其中miR-192表達明顯上調，miR-29a表達明顯下調，兩者單獨或聯(lián)合檢測用于診斷肝硬化的價值明顯優(yōu)于APRI、FIB-4、AAR三項傳統(tǒng)肝硬化血清學無創(chuàng)診斷指標。此外，本研究證實血清miR-192、miR-29a表達水平以及兩者聯(lián)合檢測的風險評分與肝硬化嚴重程度有較好的相關性，可能成為評估肝硬化程度較為理想的臨床指標。本研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-192、miR-29a表達水平在乙型肝炎與非乙型肝炎肝硬化組間無明顯差異，表明兩者與肝硬化病因無直接聯(lián)系，而與病情進展關系更為密切。

綜上所述，miR-192、miR-29a以及兩者聯(lián)合檢測的風險評分可作為肝硬化無創(chuàng)診斷和評估新的血清分子標記物。本研究在研究設計和方法學方面仍存在一定缺陷，如血清miRNAs的檢測僅在臨床確診肝硬化患者中進行、納入的臨床樣本數(shù)量偏小、未能與肝活檢結果進行比對等。后續(xù)研究將進一 步關注包括miR-192、miR-29a在內的血清miRNAs表達譜對不同程度肝纖維化和早期肝硬化的診斷價值。隨著臨床研究的不斷深入以及樣本量的逐步擴大，血清miRNAs檢測將可能為肝硬化無創(chuàng)診斷提供新的臨床依據(jù)和研究方向。

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(2016-03-28收稿；2016-04-04修回)

Value of Serum miR-192 and miR-29a for Non-invasive Diagnosis of Liver CirrhosisYEChanghong1,LINLin1,CHUYimin2,JIMeng1,ZENGXin1,LINYong1.1DepartmentofGastroenterology,ShanghaiChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai(200003);2DepartmentofEndoscopy,TongrenHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai

Correspondence to: LIN Yong, Email: linyongmd@163.com

Background: Diagnosis of liver cirrhosis in early stage with early intervention may stabilize disease progression, avoiding or delaying the occurrence of decompensation. Seeking non-invasive serum biomarkers is becoming an important topic in the diagnosis and assessment of liver cirrhosis. Aims: To study the value of serum miR-192 and miR-29a as non-invasive biomarkers for the diagnosis of liver cirrhosis. Methods: Differentially expressed serum miRNAs between patients with liver cirrhosis and healthy controls were screened through online literature retrieval and then confirmed by real-time PCR. Serum levels of two confirmed miRNAs, miR-192 and miR-29a were analyzed in 120 patients with liver cirrhosis and 76 healthy volunteers by real-time PCR. A mathematical model of combined detection of miR-192 and miR-29a for diagnosis of liver cirrhosis was established by binary logistic regression. The diagnostic performance of various non-invasive serum indicators was evaluated by ROC curve analysis. Results: Compared with healthy controls, expression level of serum miR-192 in cirrhotic patients was significantly increased and that of serum miR-29a was significantly reduced (P<0.001). The diagnostic performance of risk score obtained from mathematical model of combined detection of serum miR-192 and miR-29a was superior to that of single miRNA detection or other non-invasive serum indicators, such as APRI, FIB-4 and ARR, the areas under ROC curve of the above mentioned indicators were 0.968, 0.887, 0.933, 0.796, 0.793, and 0.571, respectively. Serum levels of miR-192, miR-29a and the risk score of their combined detection were significantly correlated with the stage of liver cirrhosis according to the Child-Pugh classification (P<0.05). Conclusions: Serum miR-192, miR-29a and the risk score of their combined detection might be novel non-invasive biomarkers for the diagnosis and assessment of liver cirrhosis.

Key wordsSerum;Biological Markers;Liver Cirrhosis;Non-Invasive Diagnosis;miR-192;miR-29a

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.05.003

*基金項目：國家自然科學基金(81170403，81370551)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(A類)

#共同第一作者，葉長虹，Email: ychdeyoujian@sohu.com；林霖， Email: linlin1989ll@126.com；褚以忞, Email: yimin_chu@163.com

&本文通信作者，Email: linyongmd@163.com