P16、CyclinD1、PTEN在皮膚基底細胞癌中的表達及意義

嚴 丹，李 靈

(1.成都市第二人民醫(yī)院皮膚科，四川 成都 610072；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚性病研究所，四川 成都 610072)

P16、CyclinD1、PTEN在皮膚基底細胞癌中的表達及意義

嚴 丹1，李 靈2

(1.成都市第二人民醫(yī)院皮膚科，四川 成都 610072；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚性病研究所，四川 成都 610072)

目的 探討P16、CyclinD1、PTEN表達與皮膚基底細胞癌(BCC)發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 在40例BCC、15例正常皮膚組織中用免疫組化EnVision染色法檢測P16、CyclinD1、PTEN的表達情況；用專業(yè)圖像分析軟件(image pro plu6.0，IPP 6.0)進行半定量分析，采用平均光密度值(optical density mean)評價陽性表達結(jié)果。結(jié)果 與正常皮膚組織比較，皮膚BCC相關(guān)組織中P16、PTEN密度值低，CyclinD1的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。BCC組織中，CyclinD1表達與P16、PTEN負相關(guān)(r=-0.502，r=-0.557，P<0.05)，P16與PTEN正相關(guān)(r=0.758，P<0.05)。結(jié)論 P16、PTEN的低表達及CyclinD1的高表達在皮膚BCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。P16、CyclinD1與PTEN三者中的兩兩相關(guān)關(guān)系提示了癌基因與抑癌基因的相互協(xié)調(diào)、相互促進可能是BCC早期分子事件。

P16； CyclinD1； PTEN；

皮膚基底細胞癌(cutaneous basal cell carcinoma，BCC)是人類最常見的皮膚惡性腫瘤，占所有皮膚惡性腫瘤的64%～75%，其發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多因素共同參與的復(fù)雜過程。癌基因與抑癌基因的相互協(xié)調(diào)及促進已成為近年來研究的熱點之一。本實驗采用免疫組織化學(xué)EnVision染色法對BCC中P16、 CyclinD1和PTEN多個基因的表達產(chǎn)物進行分析研究，旨在更深入了解BCC的發(fā)生發(fā)展，為臨床上BCC的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 四川省人民醫(yī)院病理科2008～2012年皮膚基底細胞癌組織病理活檢蠟塊40例，所有標本經(jīng)由病理科醫(yī)師核實診斷，均有完整隨訪資料。其中男 27例，女13例，年齡33～92歲[(61.40±12.60)歲]。其中面部24例，頸部3例，耳部2例，背部及頭皮各2例，胸部、腹部各3例，陰莖1例。另選15例手術(shù)切除BCC邊緣的皮膚組織，作為對照組，經(jīng)病理醫(yī)師診實為正常皮膚組織。

1.2 儀器和試劑 Olympus 光學(xué)顯微鏡；數(shù)碼相機(model DMLA，Leica Inc，德國)；image pro plu6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)；P16鼠抗人單克隆抗體(Neomaeker公司，美國)； CyclinD1兔抗人單克隆抗體ZA-0101；PTEN鼠抗人單克隆抗體ZM-0221；Envision及DAB顯色試劑盒(Dako公司，丹麥)。

1.3 免疫組化方法 將蠟塊常規(guī)連續(xù)切成4 μm厚共4張。1張進行HE染色，其余3張采用免疫組化EnVision染色法。嚴格按照試劑盒說明方法進行免疫組化染色，所有切片表片、脫水、染色均在相同條件下進行，以已知陽性的皮膚BCC組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 圖像收集分析方式 根據(jù)Kraan等[1]采用計算機圖像分析系統(tǒng)分別對免疫組化染色切片進行半定量分析。建立統(tǒng)一的圖像采集、分隔及處理標準，每次均在開機后20分鐘后，在顯微鏡下相同的曝光時間放大20倍物鏡下采集圖像。在更換視野或切片時，除了對焦，其他所有的操作都不能有變化。從每張切片中選取一有代表性區(qū)域，選取5個不重疊高倍視野，用IPP圖像分析軟件測定其面積(area)及累積光密度(IOD)，累積光密度除以面積得到平均光密度，將平均光密度值作平均及標準差進行統(tǒng)計分析。

1.5 結(jié)果判定 P16蛋白染色陽性為細胞核或者漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質(zhì)，其著色度明顯比背景非特異染者要深；PETN陽性細胞漿和細胞核為出現(xiàn)深黃或棕黃顆粒； CyclinD1陽性為細胞核與細胞漿內(nèi)出現(xiàn)深黃或棕黃顆粒，且著色程度明顯比非特異性染色要高。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。關(guān)聯(lián)性分析采用秩相關(guān)檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16染色陽性細胞分布 P16陽性著色呈黃色或棕黃色，表達定位于胞漿或胞核，見圖1。癌組織中未見P16表達，癌旁組織正常表皮中可見少量的陽性表達，正常表皮見強陽性表達。

圖1 P16免疫組化染色 a：BCC(×100)；b：BCC(×200)；c：癌旁正常皮膚組織(×100)；d：癌旁正常皮膚組織(×200)；e：正常表皮組織(×100)；f：正常表皮組織(×200)

2.2 CyclinD1染色陽性細胞分布 CyclinD1陽性著色呈明顯的黃色及棕黃色，表達定位于細胞核及胞漿，見圖2。癌組織中可見CyclinD1的強陽性表達，癌旁組織正常表皮中可見少量陽性表達，正常表皮中未見CyclinD1的陽性表達。

2.3 PTEN染色陽性細胞分布 PTEN陽性著色呈黃色或棕黃色，表達定位于細胞核及胞漿，見圖3。癌組織中見PTEN不表達或弱陽性表達，癌旁組織表皮及正常表皮可見PTEN的陽性表達。

2.4 P16、CyclinD1、PTEN在正常皮膚組織及BCC中的表達 基底細胞癌與正常組織中P16、CyclinD1、PTEN三者的表達比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見表1。

圖2 CyclinD1免疫組化染色 a：BCC(×100)；b：BCC(×200)；c：癌旁正常皮膚組織(×100)；d：癌旁正常皮膚組織(×200)；e：正常表皮組織(×100)；f：正常表皮組織(×200)

圖3 CyclinD1免疫組化染色 a：BCC(×100)；b：BCC(×200)；c：癌旁正常皮膚組織(×100)；d：癌旁正常皮膚組織(×200)；e：正常表皮組織(×100)；f：正常表皮組織(×200)

2.5 P16、CyclinD1、PTEN在BCC中關(guān)系 P16和CyclinD1的平均光密度值之間呈負相關(guān)(r=-0.497，P<0.05)，PTEN 和CyclinD1的平均光密度值呈負相關(guān)(r=-0.546，P< 0.05)；PTEN 和P16的平均光密度值呈正相關(guān)(r=0.742，P<0.05)；見圖4～6。

表1 P16、CyclinD1、PTEN在BCC與正常皮膚組織中的平均光密度比較

圖4 P16與CyclinD1在癌細胞中光密度均值比較

圖5 PTEN與CyclinD1在癌細胞中光密度均值比較

圖6 P16與PTEN在在癌細胞中光密度均值比較

3 討論

免疫組化技術(shù)日趨成熟，在前期染色方面采用多種手段，嚴格控制各項操作步驟，使染色具有較高可重復(fù)性，但是良好的染色切片并不代表最終的結(jié)果，如何對染色的切片進行標準化定量是一個關(guān)鍵問題。光密度是指在同一照明強度下吸收光的物質(zhì)的光學(xué)密度，是一個對數(shù)值，直接與染色物質(zhì)的量相關(guān)的。累積光密度是整個視野內(nèi)陽性染色的像素強度值全部累加起來得到的值；平均光密度是累積光密度除以一個適當(dāng)?shù)拿娣e得到的值，這個面積即圖片中陽性表達的區(qū)域[2]。由此可看出平均光密度將面積因素考慮在內(nèi)，以BCC為例，癌組織成巢狀分布，同樣面積的圖片照進來的癌巢越多，陽性表達的物質(zhì)就越多，累積光密度值就越大，照進來的癌巢越少，陽性表達的物質(zhì)就越少，累積光密度值就越小，這里就很難控制每次拍照都能準確地照進同樣多的癌組織，重復(fù)性較差。因此我們將累積光密度除以癌巢的面積，得到的一個平均光密度，則無論照進來的癌組織多少都具有可比性。

P16是位于染色體9p21區(qū)的多腫瘤抑癌基因，能特異地與細胞周期素依賴激酶4(CDK4)或CDK6緊密結(jié)合，抑制對pRb的磷酸化作用，結(jié)合轉(zhuǎn)錄活化因子E2F，最后阻止細胞周期G1期進展，導(dǎo)致細胞無限制生長[3]。目前研究表明，P16基因的缺失和蛋白水平的下降甚至缺失與很多腫瘤密切相關(guān)，并且不同類型腫瘤P16基因缺失的發(fā)生率不同。武欽學(xué)等[4]采用免疫組化SP法檢測34例BCC，11例脂溢性角化病及10例正常皮膚，結(jié)果顯示P16在BCC中均有不同程度的失表達，脂溢性角化病及正常皮膚正常表達，提示其表達的異?？赡芘cBCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但與表皮良性腫瘤發(fā)生無關(guān)。本研究顯示P16在正常皮膚組織中呈陽性表達，在BCC中表達缺失，表明在皮膚基癌組織中P16的基因變異及蛋白低表達導(dǎo)致其抑癌作用減弱，與BCC的發(fā)病相關(guān)。外源性P16導(dǎo)入癌組織可引起腫瘤細胞的凋亡，但具體實施尚需進一步研究和探索。

CyclinD1已被公認為一種新的原癌基因[5]。CyclinD1由染色體11q13上的CCND1編碼，含有295個氨基酸，有5個外顯子，全長15 kb。其與CDk4/CDK6結(jié)合形成復(fù)合外物，并使之激活，使pRb發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致E2F釋放，進一步激活S期DNA的轉(zhuǎn)錄合成，推動細胞從G1期進入S期[6]。CyclinD1還有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能，包括許多轉(zhuǎn)錄因子和核受體(雌激素受體，雄激素受體、甲狀腺激素受體等)，它通過提高轉(zhuǎn)錄水平或者抑制轉(zhuǎn)錄影響細胞的分化導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7]。目前，國內(nèi)外資料表明，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了CyclinD1過表達和基因擴增。孫桂彬等[8]應(yīng)用免疫組化S-P法檢測正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌組織中PTEN、P16、CyclinD1蛋白的表達情況，提示PTEN、P16表達降低，CyclinD1表達升高，可能是胃癌早期分子事件。王世軍等[9]采用免疫組化技術(shù)檢測凋亡抑制因子livin和CyclinD1在30例外鼻BCC和18例外鼻正常組織中的表達，并觀察兩者在外鼻BCC表達的相關(guān)性，CyclinD1在外鼻BCC組織中陽性表達率明顯高于外鼻正常組織，提示其參與外鼻BCC的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究顯示：CyclinD1在BCC中有較高的陽性表達，與既往的結(jié)果相符，提示CyclinD1異常表達可能與皮膚基癌分化和預(yù)后相關(guān)。

PTEN作為一種重要的抑癌基因編碼蛋白，其突變或丟失，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用。它定位于人染色體10q23，含9個外顯子，編碼雙特異性磷酸酯酶蛋白，具有抑癌活性[10]。通過其脂質(zhì)磷酸酶活性，抑制蛋白激酶B通路，阻斷細胞所接受的外界生存增殖信號，使細胞周期阻滯；通過蛋白磷酸酶活性，使局灶黏附激酶(FAK)脫磷酸，從而抑制細胞黏附和遷移[11]。文獻報道，將乳癌細胞轉(zhuǎn)入PTEN抑癌基因，可以使腫瘤細胞發(fā)生死亡，相反，本應(yīng)死亡的變異細胞當(dāng)PTEN基因突變或缺失，將無節(jié)制生長，形成腫瘤[12]。郭麗麗等[13]應(yīng)用免疫組化SP法檢測23例BCC、25例SCC和10例正常皮膚組織中PTEN和Fas蛋白的表達，結(jié)果BCC和SCC中PTEN表達陽性率明顯低于正常皮膚，PTEN蛋白在正常皮膚組織中高表達，而在BCC及SCC中低表達，提示PTEN抑癌基因在皮膚癌中可能發(fā)生突變和失活，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究中，PTEN蛋白在BCC的表達水平、表達強度均低于正常皮膚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，與以往的研究結(jié)果相符。提示：PTEN低表達，使組織調(diào)控細胞增殖功能下降，細胞凋亡減少，組織中的細胞過度增殖堆積，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

孫桂彬等[13]在研究P16和CyclinD1在胃癌及癌前病變表達中得出二者在該腫瘤中表達呈顯著負相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)二者在BCC中表達呈負相關(guān)。由此證明，PTEN可能控制CyclinD1對BCC的分化和轉(zhuǎn)移。武衛(wèi)等[14]等研究發(fā)現(xiàn)在膀胱移行細胞癌中PTEN和CyclinD1呈明顯的負相關(guān)。徐波等[15]在研究PTEN和 CyclinD1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達中，得出二者在該腫瘤中的表達呈顯著負相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)二者兩兩關(guān)系與上述結(jié)果相同。目前公認的調(diào)節(jié)細胞周期G1/S期經(jīng)典途徑是P16→CyclinD1→pRb途徑，P16可與CyclinD1競爭性結(jié)合CDK4抑制CDK4/CyclinD1復(fù)合物催化活性，阻止G1→S期轉(zhuǎn)變，負向調(diào)節(jié)抑制細胞增殖。PTEN可以通過AKT/PKB信號通路使GSK-3磷酸化而失活。失活的GSK-3就不能磷酸化CyclinD1的Thr-286而引發(fā)其更新，從而不能穩(wěn)定CyclinD1，所以在腫瘤組織中PTEN的表達抑制了CyclinD1的過量堆積，調(diào)控了細胞增殖。這一機制可能是目前公認的P16→CyclinD1→pRb途徑之外的又一CyclinD1過表達的原因。P16、PTEN同為抑癌基因，且均與CyclinD1蛋白有關(guān)，在分析本實驗癌組織中P16和PTEN蛋白表達的相互關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，P16與PTEN呈正相關(guān)，二者可能在腫瘤的發(fā)生過程中存協(xié)同作用，由此表明，癌基因及抑癌基因相互協(xié)調(diào)、相互促進導(dǎo)致P16與PTEN的缺失以及CyclinD1的擴增或過表達從而導(dǎo)致了皮膚基癌的發(fā)生發(fā)展。檢測其表達對認識皮膚基癌發(fā)病的分子機制、惡性變、預(yù)后和治療均有一定幫助。但BCC是多步驟、多因素共同參與的復(fù)雜過程，具體機制還需進一步深入研究證實。

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The expression of P16，cyclinD1 and PTEN in basal cell carcinoma of skin and their significance

YAN Dan1，LI Ling2

(1.Department of Dermatology，Chengdu Second People’s Hospital，Chengdu 646000，China；2.Department of Dermatology，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

LILing

Objective To investigate the association of expressions of P16，cyclinD1 and PTEN with occurrence and development of skin basal cell carcinoma (BCC).Methods The expressions of P16，cyclinD1 and PTEN in 40 cases with BCC and 15 of healthy skin tissues were examined with immunohistochemical staining.IPP6.0 image analysis equipment was used for half-quantitative analysis and average optical density value was used to express a positive result.Results The density values of P16 and PTEN were lower and cyclinD1 expression was higher than that of normal skin tissues (P< 0.05).In BCC，the expression of cyclinD1 was negatively correlated with P16 and PTEN (r=-0.502 and-0.577，respectively，P< 0.05) while P16 was positively correlated with PTEN (r= 0.758，P< 0.05).Conclusion The low expressions of P16 and PTEN and high expression of cyclinD1 play an important role in occurrence and development of BCC.The correlations between P16，cyclinD1 and PTEN suggest that coordination and promotion each other between oncogene and tumor suppressor genes may be early molecular events of basal cell carcinoma.

P16;CyclinD1;PTEN

李 靈

R 739.5

A

1672-6170(2016)03-0016-05

2015-09-15；

2016-02-02)