李遠(yuǎn) 黃潔瓊 李佳俊 汪維鵬 張洪建

（蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215123）

CYP2C8及CYP3A4細(xì)胞表達(dá)體系的構(gòu)建及其在小分子激酶藥物對(duì)紫衫醇代謝途徑抑制研究中的應(yīng)用

李遠(yuǎn) 黃潔瓊 李佳俊 汪維鵬 張洪建

（蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215123）

構(gòu)建CYP2C8及其3種突變體細(xì)胞表達(dá)體系，以紫杉醇為底物研究CYP2C8基因多態(tài)性對(duì)其酶活性的影響，以及構(gòu)建CYP2C8和CYP3A4共轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系研究小分子激酶抑制劑對(duì)紫杉醇代謝途徑的抑制。根據(jù)基因文庫(kù)分別合成CYP3A4以及CYP2C8及其3種突變體CYP2C8*2（805A＞T）、CYP2C8*3（416G＞A，1196A＞G）、CYP2C8*4（792C＞G）的基因編碼片段，將其連接到PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。將CYP2C8野生型及其突變體分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24 h后加入紫杉醇進(jìn)行孵育，通過(guò)建立好的LC-MS/MS方法對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析。同時(shí)，也將野生型CYP2C8和CYP3A4質(zhì)粒按一定的濃度比轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞構(gòu)建共表達(dá)體系。并篩選出合適的質(zhì)粒濃度比轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在加入紫杉醇孵育時(shí)，同時(shí)加入小分子激酶抑制劑，考察小分子激酶抑制劑對(duì)紫杉醇代謝途徑的抑制作用。結(jié)果表明，CYP2C8*4代謝酶對(duì)紫杉醇的代謝能力存在明顯差異，其中CYP2C8 *2和CYP2C8 *3代謝活性分別是野生型的81%（P＜0.05）和87%（P＜0.05），而CYP2C8*4則是野生型的65%（P＜0.01）。 尼洛替尼完全抑制了紫杉醇的代謝，阿法替尼對(duì)紫杉醇的兩條代謝途徑抑制達(dá)30%，而伊馬替尼選擇性抑制了CYPD3A4的活性。不同基因型CYP2C8對(duì)紫杉醇的代謝存在差異，可能是導(dǎo)致臨床療效不同的原因。小分子激酶抑制劑在與紫杉醇聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)紫杉醇代謝的抑制各不相同。

紫杉醇；代謝酶；基因多態(tài)性；小分子激酶抑制劑；藥物相互作用

CYP2C8是CYP2C家族中最晚發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員，大約占CYP2C家族的26%。 CYP2C8主要分布在肝臟，占肝CYP代謝酶總量的7%；其在肝臟外的組織中也存在少量的分布［1］。CYP2C8參與催化大約5%的臨床藥物，并且存在著明顯的基因多態(tài)性，對(duì)藥物的代謝清除有著明顯的影響［2］。常見(jiàn)的CYP2C8基因多態(tài)性包括CYP2C8*2（805A＞T）、*3（416G＞A，1196A＞G）、*4（792C＞G），其中CYP2C8*2只在非洲人中被發(fā)現(xiàn)，等位基因頻率為19%，CYP2C8*3和CYP2C8*4只在白種人中被發(fā)現(xiàn)，等位基因頻率分別為23.5%和5.8%，其他CYP2C8基因多態(tài)的頻率較低［3］。目前已經(jīng)知道CYP2C8的不同基因型對(duì)抗糖尿病藥物［4］，抗腫瘤藥物［5］，非甾體抗炎藥［6］等藥物的代謝過(guò)程有著重要的影響。

紫杉醇是一種抗微管細(xì)胞毒素藥物，它通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合、抑制解聚、保持微管蛋白穩(wěn)定、抑制細(xì)胞有絲分裂和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。紫杉醇具有較廣的抗癌譜，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、頭頸部癌等惡性腫瘤［7-9］。紫杉醇在人體內(nèi)能夠被CYP3A4和CYP2C8代謝，分別生成p-3'-羥基紫杉醇和6α-羥基紫杉醇［10，11］。在人肝微粒體中，6α-羥基紫杉醇的生成量高于p-3'-羥基紫杉醇，表明CYP2C8在紫杉醇體內(nèi)代謝清除過(guò)程中扮演著重要角色［12］。為了達(dá)到更好的治療效果，紫杉醇經(jīng)常與一些小分子激酶抑制劑等新型抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，以使抗腫瘤功效最大化。雖然聯(lián)合療法已較多報(bào)道，但是紫杉醇在與這些小分子激酶抑制劑聯(lián)用時(shí)，藥物之間的相互作用目前還鮮有報(bào)道。因而有必要研究清楚各種小分子激酶抑制劑及藥物對(duì)酶的抑制作用。

在不同的病人體內(nèi)，紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)的變化各不相同，這種變化與CYP3A4和CYP2C8表達(dá)及酶活性的不同有著緊密的聯(lián)系。近年來(lái)也進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究CYP酶的多態(tài)性，以及它們與個(gè)體化差異的關(guān)系在紫杉醇的藥效和毒性中起到的作用［13］。例如，CYP2C8*3與高效的臨床反應(yīng)以及神經(jīng)毒性風(fēng)險(xiǎn)的提高有關(guān)［14-16］。CYP3A4*22基因型能夠影響有紫杉醇引起的神經(jīng)毒性［17］。這 些都表明不同基因型的CYP酶對(duì)紫杉醇的代謝情況存在差異，這些差異將會(huì)影響到紫杉醇的抗癌作用和毒副作用。而本課題將研究紫杉醇在不同基因型的CYP2C8代謝酶中的代謝情況。

為了更好地研究紫杉醇與CYP2C8、CYP3A4代謝酶以及小分子激酶抑制劑的關(guān)系，需要構(gòu)建一個(gè)合適的系統(tǒng)。目前常用的系統(tǒng)有細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)［18］、酵母表達(dá)系統(tǒng)［19］、昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)［20］和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)［21］。P450酶在不同的表達(dá)系統(tǒng)中有著各自的表達(dá)特點(diǎn)。最終，本研究選擇了哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)——HepG2細(xì)胞株。HepG2細(xì)胞株與其它主要的人肝細(xì)胞相比，更加的經(jīng)濟(jì)和使用方便。由于它來(lái)源于原發(fā)性肝癌的活體組織，保留了許多外源性物質(zhì)的P450代謝活性［22］，但CYP酶活性較低［23］，更為重要的是HepG2細(xì)胞內(nèi)含有P450酶催化活性所必需的CYP450 氧化還原酶和細(xì)胞色素b5等輔助因子［24］。因此它是用來(lái)研究CYP450介導(dǎo)藥物代謝的一個(gè)理想的系統(tǒng)［25］。通過(guò)P450酶表達(dá)系統(tǒng)，可以避免體內(nèi)藥物研究存在的安全性低，通量低，易受外界條件影響等缺點(diǎn)［26］，從而能夠更加準(zhǔn)確的研究藥物之間相互作用以及不同的基因型對(duì)藥物的代謝的影響，為臨床用藥安全提供更多的參考和更好的保障。本研究利用生物合成學(xué)的方法，構(gòu)建CYP2C8及其3種突變體細(xì)胞表達(dá)體系，以紫杉醇為底物研究CYP2C8基因多態(tài)性對(duì)其酶活性的影響，以及構(gòu)建CYP2C8和CYP3A4共轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系研究小分子激酶抑制劑對(duì)紫杉醇代謝途徑的抑制，以期為臨床給藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞購(gòu)自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；FBS（胎牛血清）、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素以及PBS緩沖液購(gòu)自Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；脂質(zhì)體2000試劑購(gòu)自Invitrogen公司；甲醇、乙腈購(gòu)自Merck公司；紫杉醇、6α-羥基紫杉醇、p-3'-羥基紫杉醇以及多西紫杉醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；阿法替尼、伊馬替尼、尼洛替尼購(gòu)自上海ChemBest公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10% FBS和1%雙抗（青霉素及鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2、飽和濕度。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI GENE（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gene/）文庫(kù)，利用合成生物學(xué)方法合成CYP2C8和CYP3A4基因，與載體pEGFP-N1進(jìn)行組裝、測(cè)序，以上步驟由金唯智公司（http://www. genewiz.com.cn/）完成。測(cè)序正確后進(jìn)行功能驗(yàn)證。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，將一定濃度的質(zhì)粒稀釋至50 μL不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，2 μL脂質(zhì)體2000懸液加入50 μL不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在室溫孵育5 min。然后將含質(zhì)粒的RPMI-1640培養(yǎng)基和含脂質(zhì)體2000的RPMI-1640培養(yǎng)基混合在一起，并充分混勻，靜置20 min，使得含質(zhì)粒的載體和脂質(zhì)體能夠充分的混合。同時(shí)準(zhǔn)備好只加入了脂質(zhì)體2000的RPMI-1640培養(yǎng)基，作陰性對(duì)照；吸去600 μL接種到24孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL上述混合物，陰性對(duì)照孔加入400 μL新鮮培養(yǎng)基 及100 μL只加入了脂質(zhì)體2000的RPMI-1640培養(yǎng)基。經(jīng)4 h后，吸棄24孔板中的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，同時(shí)向各孔加入1 mL的含有血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 活性測(cè)試 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h之后，用KHB緩沖液清洗細(xì)胞兩次。用KHB緩沖液配制濃度為5 μmol/L的紫杉醇作為探針底物，每孔500 μL進(jìn)行孵育。4 h后，取出24孔板，每孔吸取100 μL KHB孵育液，加入到含有內(nèi)標(biāo)的100 μL有機(jī)溶劑中。振蕩2 min后，1.3×104r/min 4℃離心10 min，吸取上層清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。具體過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 合成CYP2C8和CYP3A4基因，與載體同源重組以及功能測(cè)試

1.2.5 抑制試驗(yàn) 細(xì)胞鋪板24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，在活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，用KHB緩沖液將各個(gè)小分子激酶抑制劑配制到臨床使用濃度，并于活性測(cè)試時(shí)與底物同時(shí)加入。將每孔細(xì)胞進(jìn)行裂解，測(cè)定蛋白濃度，并利用蛋白濃度來(lái)對(duì)活性測(cè)試結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2.6 LC-MS/MS分 析 CYP2C8和CYP3A4的 代謝產(chǎn)物通過(guò)LC-MS/MS系統(tǒng) 來(lái)進(jìn)行定量分析。美國(guó)Applied Biosystems公司API 4000 Q Trap三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子 源（Turbo I onS prav），高效液相分離包括LC-20AD泵，CBM-20A控制器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，Shimadzu CTO-20A柱溫箱。電離源為ESI源，正離子方式檢測(cè)，噴霧電壓為5.5 kV，霧化溫度為500℃，氣簾氣CUR為20 L/min，輔助氣AUX（GAS2）為65 L/min。掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。采用Agela Venusil XBP C18 色譜柱（50×2.1 mm；5 μm）實(shí)現(xiàn)代謝物分離，柱溫40℃，流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相為A相（水∶乙腈=95∶5）與B相（水∶乙腈=5∶95）梯度混合。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS檢測(cè)方法

建立紫杉醇代謝物（6 α-羥基紫杉醇和p-3'-羥基紫杉醇）專(zhuān)屬靈敏的LC-MS/MS方法，進(jìn)行定量檢測(cè)。采用正離子模式，選擇離子對(duì)m/z 892.4→324.1、m/z 892.3→308.1和m/z 830.3→549.4分別測(cè)定p-3'-羥基紫杉醇、6α-羥基紫杉醇和多西紫杉醇（內(nèi)標(biāo)）的含量；色譜圖如圖2所示。代謝物與內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，峰形良好，無(wú)干擾。

圖2 紫杉醇代謝物L(fēng)C-MS/MS色譜圖

2.2 CYP2C8的基因多態(tài)性對(duì)紫杉醇代謝的影響

為了研究CYP2C8的不同基因型對(duì)紫杉醇代謝的影響，分別構(gòu)建了CYP2C8野生型質(zhì)粒（WT）和3種突變型質(zhì)粒，包括*2（805A＞T）、*3（416G＞A，1196A＞G）和*4（792C＞G）。分別將其轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞后進(jìn)行功能測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。轉(zhuǎn)染了CYP2C8野生型及不同基因型質(zhì)粒后，6α-羥基紫杉醇的生成量顯著增加，且在不同的CYP2C8基因型細(xì)胞之間，6α-羥基紫杉醇的生成量存在差異。其中CYP2C8 *2和*3代謝活性分別是野生型的81%（P＜0.05）和87%（P＜0.05），而*4則僅為野生型的65%（P＜0.01）。

2.3 CYP3A4和CYP2C8共表達(dá)體系的構(gòu)建

紫杉醇能夠同時(shí)被CYP2C8和CYP3A4代謝生成6α- 羥基紫杉醇和p-3'-羥基紫杉醇。HepG2細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)入不同比例的CYP2C8和CYP3A4后的功能測(cè)試結(jié)果如圖4所示。轉(zhuǎn)染了CYP2C8和CYP3A4的細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物生成顯著增加，并且隨著CYP2C8比例的提高，6α-羥基紫杉醇生成量與p-3'-羥基紫杉醇生成量之比也隨之升高。同時(shí)，當(dāng)CYP3A4與CYP2C8質(zhì)粒濃度比為1∶5時(shí)，CYP3A4和CYP2C8參與紫杉醇代謝比例（活性比）與體外人肝微粒體結(jié)果相似［13］，因此用該轉(zhuǎn)染比例進(jìn)行后續(xù)的抑制試驗(yàn)。

圖3 轉(zhuǎn)染CYP2C8不同基因型質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的6α-羥基紫杉醇生成量

圖4 不同濃度比的CYP3A4和CYP2C8質(zhì)粒，6α-羥基紫杉醇和p-3'-羥基紫杉醇的生成量

2.4 小 分子激酶抑制劑對(duì)紫杉醇代謝途徑的抑制

CYP3A4和CYP2C8質(zhì)粒濃度比為1∶5時(shí)（對(duì)照組），小分子激酶抑制劑阿法替尼、伊馬替尼和尼洛替尼對(duì)紫杉醇代謝途徑的抑制結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，尼洛替尼完全抑制了紫杉醇的代謝，阿法替尼對(duì)紫杉醇的兩條代謝途徑抑制達(dá)30%，而伊馬替尼選擇性抑制了CYP3A4的活性。

3 討論

體外藥物代謝研究通常以肝微粒體、胞漿、S9或原代肝細(xì)胞等為主要體系。較之肝微粒體，原代肝細(xì)胞存在著來(lái)源、質(zhì)量、較大的個(gè)體差異等不利因素。因此，構(gòu)建穩(wěn)定可控的體外細(xì)胞代謝體系，不僅可以避免原代肝細(xì)胞的各種缺陷，同時(shí)也會(huì)較大提高研究及藥物篩選的效率。合成生物學(xué)具有簡(jiǎn)單準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，可以將目標(biāo)基因（如CYP同工酶）構(gòu)建成相對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，進(jìn)行表達(dá)，獲得單一的高表達(dá)的CYP酶或者按照一定比例的不同的CYP酶的共表達(dá)體系，從而能夠更加準(zhǔn)確、便捷地進(jìn)行藥物代謝研究。

圖5 阿法替尼、伊馬替尼、尼洛替尼對(duì)紫杉醇代謝的抑制

代謝研究的另一個(gè)挑戰(zhàn)是代謝酶的基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性是指同一人群的同一基因位點(diǎn)上存在多個(gè)等位基因形態(tài)，并且遵循孟德?tīng)栠z傳定律［26］。由于超過(guò)半數(shù)以上的藥物都是由CYP450介導(dǎo)代謝的，CYP450的基因多態(tài)性已經(jīng)成為造成藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要原因。本研究以CYP2C8為目標(biāo)，合成了CYP2C8*1、*2、*3 及*4的關(guān)鍵基因，構(gòu)建了獨(dú)立的HepG2表達(dá)體系。在研究過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了CYP2C8質(zhì)粒的細(xì)胞的6α-羥基紫杉醇的生成量與空白和只加了脂質(zhì)體2000的細(xì)胞相比具有顯著的增加，同時(shí)在轉(zhuǎn)染了CYP2C8野生型和突變體質(zhì)粒的細(xì)胞中，6α-羥基紫杉醇的生成量存在著差別。這些結(jié)果說(shuō)明了構(gòu)建的細(xì)胞表達(dá)體系具有代謝功能，不同基因型CYP2C8對(duì)紫杉醇的代謝作用存在著“基因劑量”的影響。

作為臨床上常用的經(jīng)典抗癌藥物，紫杉醇能夠同時(shí)被CYP3A4和CYP2C8代謝。由于捐獻(xiàn)者之間的基因差異，健康狀況和用藥歷史的不同，肝微粒體中P450酶的活性也不相同，紫杉醇的代謝產(chǎn)物6α-羥基紫杉醇和p-3'-羥基紫杉醇生成量的比值也不相同［27］。在我們之前的研究中，6α-羥基紫杉醇的生成量大約是p-3'-羥基紫杉醇的9倍。這說(shuō)明盡管CYP2C8在肝中的表達(dá)量低于CYP3A4，但其在紫杉醇的代謝清除中起主導(dǎo)作用。甚至在有些捐獻(xiàn)者的肝微粒體中，6α-羥基紫杉醇的生成量能達(dá)到p-3'-羥基紫杉醇的13倍［12，28］。在膽汁和尿液中，6α-羥基紫杉醇的生成量能達(dá)到p-3'-羥基紫杉醇的4倍，紫杉醇引起的神經(jīng)毒性的程度和CYP2C8的活性以及6α-羥基紫杉醇的生成量一致。這說(shuō)明P450酶介導(dǎo)的紫杉醇代謝是影響其臨床藥效的主要因素，因此應(yīng)該重視藥物與藥物之間的相互作用，并尋求基于紫杉醇的聯(lián)合療法來(lái)達(dá)到更好的治療效果。

由于紫杉醇能夠同時(shí)被CYP3A4和CYP2C8代謝，所以本研究選擇紫杉醇作為一個(gè)合適的探針底物來(lái)研究藥物對(duì)CYP2C8和CYP450抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們成功構(gòu)建了CYP2C8和CYP3A4的HepG2的雙轉(zhuǎn)體系，并驗(yàn)證了其代謝功能，在該HepG2的雙轉(zhuǎn)細(xì)胞中，根據(jù)p-3'-羥基紫杉醇和6α-羥基紫杉醇的生成量可以反映CYP3A4和CYP2C8的代謝活性。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)入的CYP3A4與CYP2C8質(zhì)粒比為1∶5時(shí)，CYP3A4 和CYP2C8參與紫杉醇代謝比例與體外微粒體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。故選擇1∶5的比例構(gòu)建的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)模擬肝微粒體體系，研究小分子激酶抑制劑對(duì)P450酶的抑制作用，來(lái)進(jìn)一步探究體內(nèi)藥物與藥物的相互作用。臨床上使用紫杉醇時(shí)常與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，產(chǎn)生了一系列的藥物相互作用，因此進(jìn)一步的體內(nèi)研究可集中于以紫杉醇為基礎(chǔ)的更安全有效的聯(lián)合療法。而在癌癥治療中，臨床上已有超過(guò)10種以上的小分子激酶抑制劑與紫杉醇進(jìn)行聯(lián)用，而與這些小分子激酶抑制劑進(jìn)行聯(lián)用時(shí)的相互作用還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用了臨床上已使用的3種小分子激酶抑制劑：尼洛替尼、阿法替尼和伊馬替尼進(jìn)行抑制研究。CYP2C8和CYP3A4酶活性的改變能夠?qū)е麓x產(chǎn)物生成量的改變，這些改變將會(huì)影響基于紫杉醇的聯(lián)合療法的療效和風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，尼洛替尼完全抑制了紫杉醇代謝途徑，阿法替尼部分抑制了紫杉醇代謝途徑，而伊馬替尼選擇性抑制了CYP3A4的活性，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

由于藥物與藥物相互作用以及個(gè)體之間的差異，在制定臨床給藥方案時(shí)需要考慮的因素也越來(lái)越多。我們需要更加著重于藥物之間的相互作用以及個(gè)體差異對(duì)藥物代謝的影響并以此給臨床用藥提供正確的指導(dǎo)，提高藥效，降低風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)運(yùn)用生物合成技術(shù)，成功構(gòu)建了CYP2C8及其3個(gè)變異體以及CYP3A4體外表達(dá)體系，以紫杉醇為底物研究了基因多態(tài)性以及小分子激酶抑制劑對(duì)酶活性的影響，其中CYP2C8 *2、CYP2C8 *3、CYP2C8 *4活性分別為野生型活性的81%、87%和65%；而在抑制實(shí)驗(yàn)中，尼洛替尼完全抑制了紫杉醇的代謝，阿法替尼對(duì)紫杉醇的兩條代謝途徑抑制達(dá)30%，而伊馬替尼選擇性抑制了CYP3A4的活性。

［1］Klose TS, Blaisdell JA, Goldstein JA. Gene structure of CYP2C8 and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs［J］. Journal of Biochemical & Molecular Toxicology, 1999, 13（6）：289-295.

［2］Nebot N, Crettol S, D’Esposito F, et al. Participation of CYP2C8 and CYP3A4 in the N-demethylation of imatinib in human hepatic microsomes［J］. Br J Pharmacol, 2010, 161（5）：1059-1069.

［3］Daily EB, Aquilante CL. Cytochrome P450 2C8 pharmacogenetics：a review of clinical studies［J］. Pharmacogenomics, 2009, 10（9）：1489-1510.

［4］Gertz M, Tsamandouras N, S?ll C, et al. Reduced physiologicallybased pharmacokinetic model of repaglinide：impact of OATP1B1 and CYP2C8 genotype and source of in vitro data on the prediction of drug-drug interaction risk［J］. Pharmaceutical Research, 2014, 31（9）：2367-2382.

［5］Khan MS, Barratt DT, Somogyi AA. Impact of CYP2C8*3 polymorphism on in vitro metabolism of imatinib to N-desmethyl imatinib［J］. Xenobiotica, 2016, 46（3）：278-287.

［6］Yu L, Shi D, Ma L, et al. Influence of CYP2C8 polymorphisms on the hydroxylation metabolism of paclitaxel, repaglinide and ibuprofen enantiomers in vitro［J］. Biopharmaceutics & Drug Disposition, 2013, 34（5）：278-287.

［7］Fountzilas G, Kalofonos HP, Dafni U, et al. Paclitaxel and epirubicin versus paclitaxel and carboplatin as first-line chemotherapy in patients with advanced breast cancer：a phase III study conducted by the Hellenic Cooperative Oncology Group［J］. Annals of Oncol, 2004, 15（10）：1517-1526.

［8］Ramalingam SS, Mlfrankel M. Carboplatin and Paclitaxel in combination with either vorinostat or placebo for first-line therapy of advanced non-small-cell lung cancer［J］. J Clin Oncol, 2010, 28（1）：56-62.

［9］郭培鳳, 郭云利. 紫杉醇應(yīng)用相關(guān)不良反應(yīng)觀察［J］. 醫(yī)學(xué)信息, 2014（2）：643.

［10］Monsarrat B, Mariel E, Cros S, et al. Taxol metabolism. Isolation and identification of three major metabolites of taxol in rat bile［J］. Drug Metabolism & Disposition, 1990, 18（6）：895-901.

［11］Walle T, Kumar GN, McMillan JM, et al. Taxol metabolism in rat hepatocytes［J］. Biochemcal Pharmacology, 1993, 46（9）：1661-1664.

［12］Taniguchi R, Kumai T, Matsumoto N, et al. Utilization of human liver microsomes to explain individual differences in paclitaxel metabolism by CYP2C8 and CYP3A4［J］. Journal of Pharmacological Sciences, 2005, 97（1）：83-90.

［13］Wang Y, Wang M, Qi H, et al. Pathway-dependent inhibition of paclitaxel hydroxylation by kinase inhibitors and assessment of drug-drug interaction potentials［J］. Drug Metabolism & Dispos, 2014, 42（4）：782-795.

［14］Leskel? S, Jara C, Leandro-García LJ, et al. Polymorphisms in cytochromes P450 2C8 and 3A5 are associated with paclitaxel neurotoxicity［J］. Pharmacogenomics Journal, 2011, 11（2）：121-129.

［15］Hertz DL, Motsinger-Reif AA, Amy Drobish, et al. CYP2C8*3 predicts benefit/risk profile in breast cancer patients receiving neoadjuvant paclitaxel［J］. Breast Cancer Research & Treatment, 2012, 134（1）：401-410.

［16］Hertz DL, Roy S, Motsinger-Reif AA, et al. CYP2C8*3 increases risk of neuropathy in breast cancer patients treated with paclitaxel［J］. Ann Oncol , 2013, 24（6）：1472-1478.

［17］Graan AJMD, Laure E, Sprowl JA, et al. CYP3A4*22 genotype and systemic exposure affect paclitaxel-induced neurotoxicity［J］. Clin Cancer Res, 2013, 19（12）：3316-3324.

［18］Behrendorff JB, Moore CD, Kim KH, et al. Directed evolution reveals requisite sequence elements in the functional expression of P450 2F1 in Escherichia coli［J］. Chemical Research in Toxicology, 2012, 25（9）：1964-1974.

［19］Imaoka S, Yamada T, Hiroi T, et al. Multiple forms of human P450 expressed in Saccharomyces cerevisiae［J］. Biochemical Pharmacology, 1996, 51（8）：1041-1050.

［20］路珂, 曾蘇, 姚形煒. 利用細(xì)菌/桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人CYP2E1［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2008, 37（2）：118-125.

［21］Gerets HHJ, Tilmant K, Gerin B, et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins［J］. Cell Biology & Toxicology, 2012, 28（2）：69-87.

［22］薛正楷. 穩(wěn)定表達(dá)人CYP3A4基因與Bama小型豬CYP3A基因的HepG_2細(xì)胞株的建立及探針?biāo)幬锎x表征的比較研究［D］. 重慶：重慶醫(yī)科大學(xué), 2009.

［23］Westerink WMA, Schoonen WGEJ. Cytochrome P450 enzyme levels in Hepg2 cells and cryopreserved primary human hepatocytes and their induction in Hepg2 cells［J］. Toxicology in Vitro, 2007, 21（8）：1581-1591.

［24］謝章明, 陳樞青. 人CYP的異源表達(dá)及其在新藥研發(fā)早期的作用［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013, 1（1）：109-113.

［25］Vignati L, Turlizzi E, Monaci S, et al. An in vitro approach to detect metabolite toxicity due to CYP3A4-dependent bioactivation of xenobiotics［J］. Toxicology, 2005, 216：154-167.

［26］梁艷, 李彥, 白清清. CYP450基因多態(tài)性研究進(jìn)展［J］. 武警醫(yī)學(xué), 2014, 25（5）：529-532.

［27］Sonnichsen DS, Liu Q, Schuetz EG, et al. Variability in human cytochrome P450 paclitaxel metabolism［J］. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 275（2）：566-575.

［28］Václavíková R, Horsky S, ?imek P, et al. Paclitaxel metabolism in rat and human liver microsomes is inhibited by phenolic antioxidants［J］. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, 2003, 368（3）：200-209.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Construction of CYP2C8 and CYP3A4，and the Inhibition of Paclitaxel Metabolism by Small Kinase Inhibitor

LI Yuan HUANG Jie-qiong LI Jia-jun WANG Wei-peng ZHANG Hong-jian
（College of Pharmaceutical Sciences，Soochow University，Suzhou 215123）

The aims of this work are to establish the cell expression system of CYP2C8 and its 3 mutants，to study the effects of gene polymorphisms on its enzymatic activities，and to investigate the effects of small molecular kinase inhibitors on paclitaxel metabolism with the established CYP2C8 and CYP3A4 co-transfected cell lines. The gene fragments of CYP3A4，CYP2C8 and its three mutants（CYP2C8*2（805A＞T），CYP2C8*3（416G＞A，1196A＞G），and CYP2C8*4（792C＞G））were synthesized based on gene bank. Then those fragments were ligated to expression plasmid PEGFP-N1 for sequencing evaluation. Twenty-four hours after the wild and mutant plasmids were transfected into HepG2 cells，paclitaxel was added and incubation proceeded，and then the metabolites were quantitatively detected by well-constructed LC-MS/MS. Concurrently，the wild CYP2C8 and CYP3A4 plasmids in certain concentration ratios were transfected into HepG2 cells，to establish a co-expression system. Screening the plasmids with proper concentration ratio and transfecting them to the cells，adding small molecule kinase inhibitor while adding paclitaxel for incubation，the inhibition of paclitaxel metabolism by small molecule kinase inhibitors was investigated. The results showed that the metabolic enzyme of different CYP2C8 caused the significant difference of paclitaxel metabolicactivity，of which the metabolic activity of CYP2C8*2，CYP2C8*3，CYP2C8*4 remained at about 80%（P ＜ 0.05），87%（P ＜ 0.05），and 65%（P ＜ 0.01），respectively，as compared to the wild type. Nilotinib completely inhibited the metabolism of paclitaxel and axitinib showed a 30% inhibition，while imatinib didn’t have any inhibitory effect. As conclusion，different genotypes of CYP2C8 differentially affect the overall paclitaxel metabolism，which might be the reason that results in the varied treatment effect in clinic. Small molecule kinase inhibitors while combined use with paclitaxel may inhibit the metabolism of paclitaxel to different extents.

paclitaxel；metabolism enzyme；gene polymorphism；small molecule kinase inhibitors；drug-drug interaction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.032

2015-10-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473278）

李遠(yuǎn)，男，學(xué)士，研究方向：藥物分析，E-mail：yuan722914@163.com；黃潔瓊為本文并列第一作者

汪維鵬，男，博士，研究方向：藥物分析，E-mail：wangweipeng@suda.edu.cn；張洪建，男，博士，研究方向：藥物分析，E-mail：zhanghongjian@suda.edu.cn