MMP-9及HIF-1α在鼻NK/T細胞淋巴瘤表達中的作用研究

韋花媚　劉坤平　羅春英　盧運龍　黃永秩　蘇群英　陸海善

(暨南大學附屬清遠人民醫(yī)院病理科，清遠511500)

MMP-9及HIF-1α在鼻NK/T細胞淋巴瘤表達中的作用研究

韋花媚①劉坤平羅春英①盧運龍①黃永秩①蘇群英①陸海善①

(暨南大學附屬清遠人民醫(yī)院病理科，清遠511500)

[摘要]目的：研究鼻NK/T細胞淋巴瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧誘導因子-1ɑ(HIF-1ɑ)的表達情況及其與患者臨床病理特征的關系。方法：選取右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為鼻NK/T細胞淋巴瘤患者，收集病理組織蠟塊標本46例(病例組)、同期內(nèi)鏡檢查取鼻甲黏膜組織經(jīng)病理學證實為黏膜慢性炎癥標本20例(對照組)，分別采用HE染色法和免疫組織化學法處理兩組標本，觀察兩組標本的病理形態(tài)、MMP-9及HIF-1ɑ的表達差異，并分析其與患者臨床病理特征的關系。結(jié)果：病例組的HIF-1α表達陽性率67.39%(31/46)、對照組表達陽性率為6.52%(3/20)，病例組的HIF-1ɑ表達顯著的高于對照組(P<0.05)。病例組的MMP-9表達陽性率71.74%(33/46)、對照組表達陽性率為6.52%(3/20)，病例組的MMP-9表達顯著的高于對照組(P<0.05)。HIF-1ɑ、MMP-9在陽性表達在Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤鼻NK/T細胞淋巴瘤患者的患者組織中出現(xiàn)高表達(P<0.05)。結(jié)論：鼻NK/T細胞淋巴瘤患者組織中HIF-1α、MMP-9呈現(xiàn)高表達，并且與患者發(fā)生Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤具有一定的關系。

[關鍵詞]鼻NK/T細胞淋巴瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；缺氧誘導因子-1α；臨床病理特征

結(jié)外鼻型NK/T細胞淋巴瘤是惡性淋巴瘤分類中較為獨立的一種，曾稱為中線特殊類型外周T淋巴瘤、中線致死性肉芽腫，其細胞類型來源主要來自于外周成熟的NK細胞，少部分來源于NK樣T細胞，故稱為NK/T細胞淋巴瘤。臨床上主要累及部分為鼻腔，病理類型改變多為鼻腔以及面中線損毀性病變，伴有血管的破壞和灶性壞死[1,2]。對于其相關病因的探討認為EB病毒的參與可能較為顯著地促進了NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，而部分學者認為基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)以及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)可能在此過程中發(fā)揮了血管侵襲、細胞外基質(zhì)破壞以及缺氧性應答等作用[3,4]，但對于其在NK/T細胞淋巴瘤中的表達以及其與相關臨床特征關系之間的研究較少，本次研究重在分析鼻NK/T細胞淋巴瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達情況及其與患者臨床病理特征的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選取右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院收集的經(jīng)病理檢查確診為鼻NK/T細胞淋巴瘤的患者的病理組織蠟塊標本46例(病例組)、同期內(nèi)鏡檢查取鼻甲黏膜組織經(jīng)病理學證實為黏膜慢性炎癥標本20例(對照組)。所有納入對象均經(jīng)臨床病理檢查確診；研究對象的臨床資料完整，可進行本次研究相關分析。病例組46例患者，年齡19～72歲，平均年齡(49.2±11.5)歲；其中男29例、女17例；病變部位分別位于：鼻腔34例、鼻咽部4例、硬腭3例、軟腭2例、扁桃體3例；根據(jù)Ann Arbor分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期14例、Ⅲ期16例、Ⅳ期8例；出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，血管浸潤24例。對照組20例患者，年齡22～58歲，平均年齡(46.1±10.7)歲，其中男12例、女8例。兩組患者的年齡、性別構(gòu)成差異不具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1.2方法

1.2.1HE染色方法石蠟切片放置于二甲苯溶液中10 min，采用乙醇水化，蘇木紫染色5 min，1%鹽酸酒精分化20 s，0.1%胺水溶液返藍30 s，伊紅溶液浸染3～5 min，之間采用流水常規(guī)沖洗30 s，之后采用中性樹膠封片。

1.2.2免疫組織化學法標本放置于90℃烤箱中烘烤25 min，二甲苯溶液浸泡兩次，每次5 min，采用不同濃度的乙醇水化后PBS洗滌3次，每次5 min，過氧化氫溶液室溫孵育10 min，檸檬酸緩沖鹽進行熱抗原修復，之后分別加入一抗和二抗(抗體均采用PBS緩沖液1∶100稀釋配置，一抗以及二抗均購自南京凱基生物科技有限公司)。DAB顯色后，采用蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3免疫組化法結(jié)果判定標準MMP-9及HIF-1α免疫組化陽性表達均為胞漿或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒，HIF-1α以胞核及胞核部分胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色顆粒為陽性，MMP-9以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。免疫組織化學法的結(jié)果判定標準，按照著色強度進行分級，0分：無色；淡黃色：1分；棕黃色：2分，褐色：3分；顯微鏡下染色陽性細胞計數(shù)：未見黃色顆粒細胞為0分；<10%：1分；10%～50%：2分；51%～80%：3分；>80%:4分；兩個得分項目相加為最終評分，(-)為總分1～2分，陰性表達；(+)為3分，弱陽性表達；(++)為4～5分，中陽性表達；(+++)為6～7分，強陽性表達。

2結(jié)果

2.1兩組患者的組織標本中HIF-1α及MMP-9 表達情況比較病例組的HIF-1α表達陽性率67.39%(31/46)、對照組表達陽性率為6.52%(3/20)，病例組的HIF-1α表達顯著高于對照組(P<0.05)，見表1，HE染色見圖1A，免疫組化染色見圖2A。

表1兩組患者的組織標本中HIF-1ɑ表達比較

Tab.1Comparison of HIF-1α expression in tissues of two groups of patients

Groupsn-++++++ZPCasegroup461571212-4.142<0.001Controlgroup2017300

圖1　HE染色(HE，×100)Fig.1　Result of HE staining(HE，×100)Note: A.Control group;B.Case group.

圖2　免疫組化(SP，×400)Fig.2　Expression of Immunohistochemical(SP，×400)Note: A.HIF-1α;B.MMP-9.

表2兩組患者組織標本中MMP-9的表達比較

Tab.2Comparison of MMP-9 expression in tissues of two group of patients

Groupsn-++++++ZPCasegroup461381312-4.42<0.001Controlgroup2017300

表3組織標本中HIF-1α表達與患者的臨床病理特征關系

Tab.3Relationship between HIF-1α expression and clinicopathological characteristics of patients

ProjectPositiveNegativeThepositiverate(%)χ2PSex0.9010.343Male21872.41%Female10758.82%Age(years)0.110.741<6017965.38%≥6014670.00%Lactatedehydrogenase1.3220.25Normal13959.09%Increase18675.00%AnnArborStage9.2340.002Ⅰ-ⅡStage101245.45%Ⅲ-ⅣStage21387.50%Cervicallymphnodemetastasis5.3310.021Yes15288.24%No161355.17%Vascularinvasion5.8040.016Yes20483.33%No111150.00%

表4組織標本中MMP-9表達與患者的臨床病理特征關系

Tab.4Relationship between MMP-9 expression and clinicopathological charocteristics of patients

ProjectPositiveNegativeThepositiverate(%)χ2PSex0.6580.417Male22775.86%Female11664.71%Age(years)0.1860.667<6018869.23%≥6015575.00%Lactatedehydrogenase1.3660.243Normal14863.64%Increase19579.17%AnnArborStage9.8290.002Ⅰ-ⅡStage111150.00%Ⅲ-ⅣStage22291.67%Cervicallymphnodemetastasis6.6610.01Yes16194.12%No171258.62%Vascularinvasion9.8290.002Yes22291.67%No111150.00%

病例組的MMP-9表達陽性率71.74%(33/46)、對照組表達陽性率為6.52%(3/20)，病例組的MMP-9表達顯著高于對照組(P<0.05)，見表2，HE染色見圖1B，免疫組化染色見圖2B。

2.2鼻NK/T細胞淋巴瘤患者的組織標本中HIF-1ɑ及MMP-9 表達與患者臨床病理特征的關系HIF-1ɑ、MMP-9在陽性表達在Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤鼻NK/T細胞淋巴瘤患者的患者組織中出現(xiàn)高表達(P<0.05)，見表3、4。

3討論

近年來對于NK/T細胞淋巴瘤的相關病因?qū)W探討分析認為，EB病毒的感染是導致其發(fā)生發(fā)展的主要原因，相關研究分析認為90%的NK/T細胞淋巴瘤由于后天性感染EB病毒而致病，相關臨床治療可以發(fā)現(xiàn)NK/T細胞淋巴瘤的治療面臨著類似其他惡性腫瘤的治療難題，其耐藥以及較為嚴重的血管侵襲性改變顯著影響了患者的臨床預后[5]。在EB病毒感染導致的致病過程中，細胞外基質(zhì)通過其與相關整合素受體的結(jié)合，從而直接釋放或者誘導宿主分泌MMP-9，作為基質(zhì)金屬家族中分子量最大的酶，可以通過破壞和降低細胞外基質(zhì)中的膠原和明膠，促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。相關研究也證實，分化較差或者侵襲性較為明顯的腫瘤細胞其細胞膜表面的MMP-9表達明顯升高[6]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)被認為在腫瘤缺氧應答中處于較為關鍵的位置，與腫瘤細胞血管的生成密切相關[7]，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)相關缺氧性細胞因子的釋放，進而調(diào)控腫瘤新生血管的生成，相關臨床研究也發(fā)現(xiàn)，通過抑制缺氧誘導因子-1ɑ(HIF-1ɑ)可能作為腫瘤治療的有效途徑[8，9]，但對于二者在NK/T細胞淋巴瘤中的表達，特別是其與相關臨床病理特征的關系研究較少。

MMP-9通過講解細胞外Ⅳ型以及Ⅴ型膠原纖維，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，筆者通過分析發(fā)現(xiàn)，病例組的MMP-9表達陽性率達71.74%，顯著高于鼻甲黏膜慢性炎癥組織的表達水平，提示了MMP-9參與到了NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程。而相關研究也證實，MMP-9除了可以通過降解細胞外基質(zhì)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，MMP-9同樣參與到了增強上皮細胞運動能力、參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成中。筆者通過研究MMP-9與相關臨床病理特征之間的關系后發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期的增加以及腫瘤發(fā)生血管侵襲或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，組織中MMP-9的表達顯著升高，進一步提示了MMP-9在NK/T細胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[10]。部分學者發(fā)現(xiàn)，隨著Ann Arbor分期的增加，MMP-9呈現(xiàn)出了較為明顯的增加趨勢，但Ⅲ期或者Ⅳ期患者差異并不明顯[11]，而Ye和Souza等[12]學發(fā)現(xiàn)，發(fā)生血管侵襲性轉(zhuǎn)移以及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例的MMP-9升高可達對照組的4～5倍，而相關機制研究表明EB病毒感染導致的癌蛋白LMP-1的激活可以促進AP-1信號通路的激活[13]，進而促進MMP-9對于血管基底膜以及細胞外膠原纖維的作用[14]。而對于HIF-1α的研究表現(xiàn)出了較為相似的結(jié)論，提示了HIF-1α參與到了NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程。筆者通過分析近年來國外相關文獻后發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以通過旁分泌途徑促進MMP-9以及HIF-1α的表達，進而促進其對于腫瘤的轉(zhuǎn)移、淋巴侵襲等作用。同時部分學者認為，腫瘤壞死因子α(TNF-α)在HIF-1α生成過程中的抑制性調(diào)節(jié)可能促進了NK/T細胞淋巴瘤的免疫逃逸以及促新生血管的生成[15]。

綜上所述，鼻NK/T細胞淋巴瘤患者組織中HIF-1ɑ、MMP-9呈現(xiàn)高表達，并且與患者發(fā)生Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤具有一定的關系，但相關信號通路的傳遞以及表達的調(diào)節(jié)機制有待于進一步研究探討。

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[收稿2015-07-09]

(編輯許四平)

Study on effect of MMP-9 and HIF-1α expression in nasal NK/T cell lymphoma

WEI Hua-Mei,LIU Kun-Ping,LUO Chun-Ying，LU Yun-Long,HUANG Yong-Yi,SU Qun-Ying,LU Hai-Shan.

Department of Pathology,Qingyuan Hospital School of Medicine,Ji′nan University,Qingyuan 511500,China

[Abstract]Objective:To study the expression of MMP-9 in nasal NK/T cell lymphoma, HIF-1ɑ and its relationship with the clinical and pathologic characteristics.Methods: 46 cases (case group) of paraffin block specimens from patients with pathologically confirmed nasal NK/T cell lymphoma were collected from the Affiliated Hospital of Youjiang Medical College For Nationalities,the same period endoscopy turbinate mucosa were confirmed by pathology in 20 cases of chronic inflammation of mucosa specimens (control group), respectively HE staining and immunohistochemistry handle two specimens, observation of the expression differences of two groups of specimens of pathological morphology, MMP-9 and HIF-1ɑ, and to analyze its relationship with the clinical and pathological features of the patients.Results: Case group HIF-1ɑ expression rate 67.39% (31/46), expression was 6.52% (3/20) in control group., the HIF-1ɑ case group were significantly higher than control group (P<0.05).Case group MMP-9 expression rate 71.74% (33/46), in the control group expression was 6.52% (3/20), MMP-9 expression in the case group was significantly higher than control group (P<0.05).HIF-1ɑ and MMP-9 in positive expression in Ann Arbor staging (Ⅲ-Ⅳ), lymph node metastasis, vascular invasion in patients with nasal NK/T cell lymphoma tissue appeared a high expression (P< 0.05).Conclusion: Nasal NK/T cell lymphoma tissue of patients with HIF-1ɑ, MMP-9 presented high expression, and there was a certain relationship between Arbor Ann stage (Ⅲ-Ⅳ), lymph node metastasis and vascular invasion.

[Key words]Nasal NK/T cell lymphoma;Matrix metal loproteinase-9;Hypoxia inducible factor alpha-1;Clinical pathological characteristics

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.020

作者簡介：韋花媚(1983年-)，女，在讀碩士，住院醫(yī)師，主要從事診斷病理學方面的研究。

通訊作者及指導教師：劉坤平(1963年-)，女，博士， 主任醫(yī)師，主要從事腫瘤病理診斷及研究工作。

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0863-04

①右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，百色533500。