Cd2+急性脅迫下方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸的變化

董蘭芳 張 琴 曾夢清 許明珠 童 潼（廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點實驗室，北海 536000）

Cd2+急性脅迫下方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸的變化

董蘭芳 張 琴 曾夢清 許明珠 童 潼
（廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點實驗室，北海 536000）

摘要：為了解Cd2+急性脅迫下方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸的變化規(guī)律，采用毒理學(xué)試驗方法，在確定Cd2+對方格星蟲毒性強度的基礎(chǔ)上，選取48h最低致死濃度為試驗濃度，研究該濃度Cd2+脅迫下方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸的動態(tài)變化。結(jié)果表明:方格星蟲死亡率隨著Cd2+濃度的升高而增加，Cd2+對方格星蟲的24h和48h的LC50分別為37.80和22.68 mg/L。在48h最小致死濃度下，Cd2+對方格星蟲體腔液蛋白酶和淀粉酶活力在試驗周期內(nèi)均表現(xiàn)為抑制，且淀粉酶活力受到的抑制作用較強； Cd2+脅迫前期脂肪酶活力顯著升高（P<0.05），24h后又顯著降低（P<0.05），48h時僅為初始水平的40%，說明低濃度Cd2+對脂肪酶活力有誘導(dǎo)作用，高濃度Cd2+則產(chǎn)生抑制。方格星蟲體腔液游離氨基酸的組成和含量在Cd2+脅迫48h內(nèi)均有顯著變化（P<0.05）。各游離氨基酸含量及氨基酸總量在24h前均無顯著變化（P>0.05），24h后先上升后下降（P<0.05），36h的游離氨基酸總量達到初始水平的2倍以上，為145.50 mg/100 mL，大部分游離氨基酸組成百分比也在24h前較穩(wěn)定，24h后呈現(xiàn)峰值變化。總之，Cd2+急性脅迫對方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸均有顯著影響（P<0.05），且消化酶活力與游離氨基酸含量和組成的變化與脅迫時間有關(guān)。

關(guān)鍵詞：方格星蟲； 鎘； 體腔液； 消化酶； 游離氨基酸

重金屬是常見的環(huán)境污染物，能引起生物機體神經(jīng)中毒，影響其繁殖與生存［1］。鎘是毒性最強的重金屬之一，廣泛應(yīng)用于電鍍工業(yè)、化工業(yè)、電子業(yè)和核工業(yè)等領(lǐng)域，大量鎘通過廢氣、廢水、廢渣等形式排入環(huán)境，造成污染。鎘有一個很長的生物半衰期（在人體中約20—30年），且進入機體的鎘能長期貯存而不易排泄［2］。聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（DNFP）已把鎘列為12種全球性環(huán)境污染物之首，世界衛(wèi)生組織（WTO）則將其作為優(yōu)先研究的食品污染物［3］。

重金屬能夠抑制水生生物的酶活，妨礙機體的代謝，還會造成生理生化指標(biāo)的改變，嚴重時將導(dǎo)致死亡［4］。近年來關(guān)于重金屬鎘對水生動物生長發(fā)育及生理生化影響的報道有很多，且主要集中于抗氧化酶、氧化損傷等相關(guān)的方面［5—7］。消化酶直接影響機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，通過分析消化酶活力的變化可進一步了解生物機體的代謝狀況和對環(huán)境的適應(yīng)程度。Brafiel等［8］的研究發(fā)現(xiàn)Cd2+脅迫28d后河蜆的纖維素酶活性與Cd2+濃度呈顯著負相關(guān)，并因此認為消化酶可以作為重金屬鎘污染的生物標(biāo)記物。陳肖肖等［9］的研究表明環(huán)境Cd2+對泥蚶淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性都有明顯的影響作用。氨基酸既是酶類物質(zhì)合成的前體，同時對生物機體的營養(yǎng)代謝、信號傳導(dǎo)、基因表達等起調(diào)控作用，研究重金屬脅迫下機體氨基酸的動態(tài)變化，有助于對生物體防御重金屬的機制有一個更深層次的理解。

“碧海藍天”曾是廣西北部灣引以為豪的生態(tài)品牌，但近年來隨著北部灣經(jīng)濟區(qū)開發(fā)的推進，北部灣近海海域環(huán)境受到影響。2010年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，北部灣近岸海水Cd2+含量范圍為0—0.54 μg/L，Cd對海洋生態(tài)系統(tǒng)潛在危害的影響程度僅次于Hg和As［10］。方格星蟲（Sipunculus nudus，S.nudus），俗稱沙蟲，是北部灣海水養(yǎng)殖最具特色的海珍品種之一。因其較固定地生活在沿海灘涂的泥沙底質(zhì)中，以沉積物中的有機碎屑為食，因而對生長環(huán)境的變化十分敏感，有“環(huán)境標(biāo)志生物”之稱。本研究在確定Cd2+對方格星蟲毒性強度的基礎(chǔ)上，選取48h最低致死濃度為試驗濃度，研究該濃度Cd2+脅迫下方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸的動態(tài)變化，以期為開展方格星蟲健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)，同時為探究底棲動物的重金屬毒害機制以及由重金屬鎘引起機體一系列生理生化的變化過程提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗用方格星蟲來源于廣西海洋研究所育苗場，挑選規(guī)格基本一致、健康活力好的個體，平均質(zhì)量（1.68±0.42）g，體長4.5—6.1 cm，于鋪有消毒沙子的塑料箱中暫養(yǎng)7d，期間每日喂食1次，試驗前1天停止投喂。

儀器設(shè)備:超低溫冰箱（Haier DW-86L626，青島）、高速冷凍離心機（Thermo KR25i，美國）、氨基酸分析儀（Sykam S-433D，德國）、超純水機（Millipore Milli-Q Biocel，美國）。

主要試劑:茚三酮，德國進口分裝； 檸檬酸、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、乙酸鈉、乙酸鉀、氫氧化鋰、甲醇、辛酸購于天津科密歐； 氯化鎘、鹽酸、乙醇、抗壞血酸、磺基水楊酸等均為國產(chǎn)分析純，試驗前氯化鎘用超純水配成Cd2+濃度為10 g/L的母液，試驗時用過濾海水稀釋成所需濃度。

試驗條件:試驗用水為過濾海水，水溫（29±1）℃，鹽度2.46%，pH 7.72。試驗在40 cm× 25 cm×20 cm塑料箱中進行，每個塑料箱內(nèi)放入2 kg經(jīng)消毒的沙子（試驗前用對應(yīng)濃度Cd2+海水溶液浸泡過夜，以消除Cd2+在海水和沙子之間的分配導(dǎo)致海水Cd2+濃度變化），每箱盛Cd2+海水溶液6 L，每個試驗組放入健康活力好的方格星蟲30條，并設(shè)置3個平行處理。試驗期間，連續(xù)充氣，不投餌，每24h換水一次。

1.2 試驗方法

方格星蟲Cd2+急性毒性試驗 根據(jù)預(yù)實驗確定Cd2+對方格星蟲24h最大致死濃度和48h最小致死濃度分別為100和5 mg/L，按照等對數(shù)間隔設(shè)置5個濃度梯度組（5、10.57、22.36、47.29和100 mg/L）和一個空白對照組。在試驗過程中隨時撈出死亡個體，觀察并記錄各方格星蟲組24h和48h的死亡個體數(shù)。死亡的標(biāo)準(zhǔn)為身體松軟，吻部伸出，對外界刺激沒有反應(yīng)，放入到自然海水中不能復(fù)活。

用直線內(nèi)插法，以濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)，死亡率概率單位為縱坐標(biāo)，求出半致死濃度（LC50），并由公式:A=48h LC50×0.3/（24h LC50/48h LC50）計算出方格星蟲對Cd2+安全濃度［11］。

Cd2+急性脅迫對方格星蟲體腔液消化酶活力和游離氨基酸的影響試驗 試驗選取Cd2+對方格星蟲48h最小致死濃度即5 mg/L為試驗組濃度，以保證大多數(shù)方格星蟲能夠存活。挑選健壯的方格星蟲30條，隨機選取4—5條用純水沖洗后濾紙吸干水分，再用剪刀剪個小口子收集體腔液，混勻后用1.5 mL離心管分裝成兩管分別用于消化酶活力和游離氨基酸含量的測定，剩余的方格星蟲在5 mg/L Cd2+濃度下進行攻毒實驗。分別在12h、24h、36h和48h，隨機選取4—5條方格星蟲用純水洗凈拭干后進行活體解剖，用同樣的方法收集體腔液并分裝。試驗設(shè)置3個平行處理，及時撈出死亡個體。

體腔液消化酶活力測定 體腔液解凍后于4℃、4000 r/min離心15min，取上清液用于消化酶活力的測定。蛋白酶活力的測定采用Folin-酚法；脂肪酶活力和淀粉酶活力的測定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒。體腔液蛋白質(zhì)量分數(shù)以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍法測定。

體腔液游離氨基酸測定 用移液槍取800 μL方格星蟲體腔液于1.5 mL離心管中，加入200 μL 10% 磺基水楊酸，充分搖勻，置于4℃冰箱中存放30min以上，取出后離心10min，取上清液，用儀器所配樣品稀釋液（0.12 mol/L pH 2.2檸檬酸鋰溶液）按1∶1溶解，最終樣品的pH應(yīng)在pH 1.80—2.00，必要時可用濃縮的LiOH調(diào)整。上述溶液用0.22 μm針式過濾器過濾后，上氨基酸自動分析儀測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行處理，先用Levene's test做方差齊性檢驗后再做單因素方差分析，若差異達到顯著（P<0.05），則用Duncan's多重法比較各組數(shù)據(jù)之間的差異，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，重復(fù)數(shù)n=3。

2 結(jié)果

2.1 Cd2+對方格星蟲的急性毒性

Cd2+對方格星蟲的急性毒性的試驗結(jié)果

表 1為方格星蟲死亡率與Cd2+濃度及時間的關(guān)系。隨著Cd2+濃度的升高，方格星蟲死亡率稱呈上升趨勢。在相同Cd2+濃度下，隨著時間延長，死亡率升高。高濃度Cd2+組的方格星蟲中毒反應(yīng)明顯且迅速，短期內(nèi)星蟲就開始劇烈扭動，隨著時間的增長吻部變細、顏色變深，活力慢慢下降，最后身體膨脹、變軟，觸手伸出，吻部形成紫色團狀物，對外界刺激沒有反應(yīng)，即死亡。而低濃度Cd2+組的方格星蟲中毒反應(yīng)較高濃度組慢，劇烈扭動不久便鉆入沙子，經(jīng)過較長時間才出現(xiàn)死亡，死亡癥狀與高濃度組相同。

表 1 Cd2+對方格星蟲急性毒性試驗結(jié)果Tab.1 The effect of acute toxicity of Cd2+on mortality

Cd2+濃度與死亡率的回歸分析 通過對Cd2+濃度對數(shù)-死亡率的回歸分析（表 2），顯示出較好的擬合度（R>0.78）［12］，這表明方格星蟲受Cd2+脅迫的致死率與Cd2+濃度密切相關(guān)。其24h和48h 的LC50分別是37.80和22.68 mg/L，安全濃度是2.45 mg/L。

2.2 Cd2+急性脅迫后方格星蟲體腔液消化酶活力的變化

如圖 1所示，在Cd2+急性中毒后，方格星蟲體腔液蛋白酶活力在12h內(nèi)顯著下降了10.94%（P<0.05），12h至48h時間段內(nèi)活力保持穩(wěn)定，沒有顯著變化（P>0.05）。這說明Cd2+對方格星蟲體腔液蛋白酶活力起一定的抑制作用。

在Cd2+脅迫下，體腔液脂肪酶活力的變化與蛋白酶不同，12h內(nèi)脂肪酶活力顯著升高（P<0.05），12—24h有一定升高但不顯著（P>0.05），24h后脂肪酶活力開始顯著降低（P<0.05），32h時的脂肪酶活力約為初始活力58%，48h時僅為初始水平的40%。這說明低濃度Cd2+對脂肪酶活力有誘導(dǎo)作用，而當(dāng)Cd2+達到一定濃度后對脂肪酶活力有較強的抑制作用。

Cd2+對方格星蟲體腔液淀粉酶活力起抑制作用，其變化規(guī)律與蛋白酶相似，顯著下降（P<0.05）后趨于穩(wěn)定。但淀粉酶活力受Cd2+的影響較蛋白酶大，12h時活力約為初始水平的72%，24h時僅為58%，24h以后淀粉酶活力有一定回升，但變化不顯著（P>0.05）。

2.3 Cd2+急性脅迫下方格星蟲體腔液游離氨基酸的變化

游離氨基酸總量的變化 Cd2+急性脅迫對方格星蟲體腔液游離氨基酸總量的影響如圖 2所示，24h內(nèi)體腔液游離氨基酸總量無顯著變化，24—36h游離氨基酸總量顯著上升（P<0.05），36h又顯著下降（P<0.05）至初始水平，36h的游離氨基酸總量達到初始水平的2倍以上，為145.50 mg/100mL。

各游離氨基酸含量的變化 Cd2+急性脅迫48h內(nèi)方格星蟲體腔液各游離氨基酸含量的變化見表 3。本研究共測定了17種氨基酸，其中胱氨酸和苯丙氨酸未檢出。48h內(nèi)15種氨基酸中除絲氨酸、蛋氨酸和亮氨酸外，其他氨基酸含量的變化都有顯著差異（P<0.05），且均在36h時達到最大值，48h時恢復(fù)初始水平。天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、精氨酸和脯氨酸含量在24h前無明顯變化，24h后開始顯著上升（P<0.05）； 谷氨酸、酪氨酸和組亮氨酸含量則在12h以后就開始上升，24h后上升顯著（P<0.05），40h后又顯著下降（P<0.05）至初始水平； 而甘氨酸和賴氨酸的含量，在Cd2+急性脅迫后的12h內(nèi)有所下降但不顯著，后一段時間同其他氨基酸含量一樣呈先升高后降低（P<0.05）至初始含量水平的趨勢。

各游離氨基酸組成的變化 表 4顯示Cd2+急性脅迫后方格星蟲體腔液游離氨基酸組成百分比的變化有一定的規(guī)律性。絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸含量占氨基酸總量百分比在48h內(nèi)沒有顯著變化（P>0.05）； 天冬氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸含量百分比在24h前無顯著變化（P>0.05），24h后顯著下降（P<0.05）后又顯著上升（P<0.05）； 丙氨酸和脯氨酸則相反，24h前無顯著變化（P>0.05），24h后顯著上升（P<0.05）再顯著下降（P<0.05）； 谷氨酸百分比在24h前就已經(jīng)開始顯著增加（P<0.05），24h后顯著下降后又上升（P<0.05）。

表 2 死亡率與Cd2+濃度對數(shù)的回歸分析Tab.2 Regression analysis between the death and concentration logarithm of Cd2+

圖 1 Cd2+急性脅迫下方格星蟲體腔液消化酶活力的變化

圖 2 Cd2+急性中毒方格星蟲體腔液游離氨基酸總量的變化

3 討論

3.1 Cd2+對方格星蟲的急性毒性及安全評價

研究表明Cd2+通過與酶類巰基、羥基和氨基的結(jié)合或置換出酶中金屬，使其活性降低或失去功能［13］； Cd2+也能引起DNA單鏈斷裂，抑制DNA聚合酶β的活性，導(dǎo)致細胞凋亡［13］。Cd2+對水生動物如魚蝦類、貝類等都有較高毒性。Cd2+對瓦氏黃顙魚、鯽、草魚、軍曹魚和克氏原螯蝦的48h LC50分別是59.14、8.68、34.81、19.87和8.31 mg/L［14—18］，對文蛤、海灣扇貝、四角蛤蜊和方斑東風(fēng)螺的48h LC50分別是2.243、4.52、5.146和13.86 mg/L［19—22］。另外，陳細香等［23］的研究得出了Cd2+對可口革囊星蟲的48h LC50是10.69 mg/L。在本研究中方格星蟲死亡率與Cd2+濃度呈正相關(guān)，即隨著Cd2+濃度的升高，死亡率增加，其24h和48h 的LC50分別是37.80和22.68 mg/L，相同時間的半致死濃度較上述瓦氏黃顙魚和草魚小，與軍曹魚的半致死濃度相近，是可口革囊星蟲半致死濃度的兩倍左右，說明方格星蟲對鎘的耐受力相對較強，較同屬星蟲動物門的可口革囊星蟲耐受更高濃度的Cd2+。

3.2 Cd2+急性脅迫對方格星蟲體腔液消化酶活力的影響

消化酶是營消化作用的水解酶類，其活性可以指示動物的代謝狀態(tài)及其對外界環(huán)境的適應(yīng)程度［24］。Cd2+等重金屬離子進入機體后，以不同的方式與底物、酶的活性產(chǎn)物及酶本身產(chǎn)生極強的親和力，從而導(dǎo)致酶活性改變，有些能對酶活產(chǎn)生抑制，有些則能激發(fā)酶的催化功能［25，26］。陳細香等［23］研究Cd2+等四種重金屬離子對可口革囊星蟲纖維素酶、淀粉酶和脂肪酶活力影響的結(jié)果表明，纖維素酶和淀粉酶活力隨Cd2+濃度升高而降低，脂肪酶活力的變化趨勢則相反且各處理組的酶活均顯著高于對照組。紅樹蜆用不同濃度水平的Cd2+處理不同的時間后發(fā)現(xiàn):Cd2+對其胃組織淀粉酶活力基本表現(xiàn)為抑制，僅在0.125 mg/L處理組表現(xiàn)為小幅度的誘導(dǎo)； 對其蛋白酶活力的影響效應(yīng)規(guī)律性不明顯； 而在脅迫初期脂肪酶活力受到顯著誘導(dǎo)，隨著時間延長酶活性下降［27］。不同濃度Cd2+對青蛤的蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活力均表現(xiàn)為不同程度的抑制［28］。

本研究結(jié)果表明，Cd2+對方格星蟲體腔液蛋白酶和淀粉酶活力的影響與上訴研究結(jié)果相似，均表現(xiàn)為抑制作用，而脂肪酶活力在Cd2+脅迫初期顯著被誘導(dǎo)，隨著時間延長酶活力又受到了顯著的抑制，這與Cd2+脅迫下紅樹蜆脂肪酶活力變化規(guī)律一致。

3.3 Cd2+急性脅迫對方格星蟲體腔液游離氨基酸的影響

方格星蟲體腔液中含有許多游離氨基酸，這些氨基酸除了用于合成蛋白質(zhì)、多肽及轉(zhuǎn)化成其他含氨物質(zhì)外，還參與一些特殊的生理代謝反應(yīng)，對方格星蟲的生命活動有重要作用。研究已表明金屬硫蛋白在機體對鎘的解毒機制中起關(guān)鍵作用［29］，氨基酸作為合成體內(nèi)金屬硫蛋白的代謝底物，研究Cd2+脅迫下方格星蟲體腔液中游離氨基酸含量的變化，可以在一定程度上反映鎘在機體內(nèi)的流轉(zhuǎn)動態(tài)，側(cè)面了解機體的解毒過程。然而，目前關(guān)于Cd2+脅迫對生物體內(nèi)游離氨基酸影響的報道較少。謝春等［30］研究了多代鎘脅迫對家蠅幼蟲血淋巴中游離氨基酸含量的影響，結(jié)果顯示:與對照組相比，鎘脅迫組家蠅3日齡幼蟲血淋巴中生糖氨基酸總量降低； 鎘脅迫10代組生酮氨基酸總量及賴氨酸濃度均升高，丙氨酸濃度降低； 鎘脅迫1和10代組游離氨基酸總量未見明顯變化。Wu等［31］對鎘脅迫下兩種基因型大麥的游離氨基酸等變化的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加Cd2+能夠顯著改變大麥組織中的游離氨基酸含量和組成，其中根部的游離氨基酸含量隨著Cd2+添加量的增加而顯著增加，而在添加5 μmol/L Cd2+時莖和葉中的游離氨基酸含量顯著降低。

表 3 Cd2+急性脅迫后方格星蟲體腔液游離氨基酸含量的變化Tab.3 The content of eachfree amino acid in S.nudus coelomic fluid after acute poisoning by Cd2+（mg/100mL）

表 4 Cd2+急性脅迫后方格星蟲體腔液各游離氨基酸占氨基酸總量百分比的變化Tab.4 The free amino acid composition in S.nudus coelomic fluid after acute poisoning by Cd2+（%）

在本研究中5 mg/L Cd2+脅迫48h內(nèi)方格星蟲體腔液游離氨基酸的含量和組成均有顯著變化。各游離氨基酸含量及氨基酸總量在Cd2+脅迫24h內(nèi)均無顯著變化，其中甘氨酸、賴氨酸等含量稍有下降，已有的研究表明重金屬能與生物體內(nèi)的甘氨酸、ATP等結(jié)合形成絡(luò)合物［19］，因此脅迫初期少量Cd2+進入體內(nèi)與氨基酸直接結(jié)合或通過形成螯合肽參與重金屬解毒造成了部分游離氨基酸的消耗。24h以后各游離氨基酸含量先顯著上升后顯著下降，且大部分氨基酸占總量的百分比出現(xiàn)顯著變化，出現(xiàn)這種變化的原因可能是隨著更多Cd2+進入體內(nèi)，機體金屬硫蛋白等解毒物質(zhì)被Cd2+飽和，在Cd2+的誘導(dǎo)下其他組織蛋白分解成大量的游離氨基酸，用以合成金屬硫蛋白、螯合肽等物質(zhì)來結(jié)合Cd2+，從而達到解毒目的。另外，重金屬對谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、超氧化歧化酶等機體解毒代謝酶活力也有明顯的誘導(dǎo)或抑制分泌的作用［32］，這些過程都能引起游離氨基酸的含量和組成發(fā)生改變。游離氨基酸這一快速增加繼而恢復(fù)初始水平的過程說明了方格星蟲對體腔液游離氨基酸含量的動態(tài)平衡具有良好的自我調(diào)節(jié)能力。

參 考 文 獻：

［1］Beauvais S L，Jones S B，Parris J T，et al.Cholinergic and behavioral neurotoxicity of carbaryl and cadmium to larval rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.Ecotoxi- cology and Environmental Safety，2001，49（1）:84—90

［2］Van Hattum B，De Voogt P，Van den B，et al.Bioaccumulation of cadmium by the freshwater isopod Asellus aquaticus L.from aqueous and dietary sources［J］.Environmental Pollution，1989，62（2—3）:129—151

［3］Ren J P，Li D F，Zhang L Y.Advances of the toxicology of cadmium［J］.Acta Zoonutrimenta Sinica，2003，15（1）:1—6［任繼平，李德發(fā)，張麗英.鎘毒性研究進展.動物營養(yǎng)學(xué)報，2003，15（1）:1—6］

［4］Zhao H X，Zhou M，Zhan Y，et al.Progress research on the aquatic toxicity of heavy metals［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2004，40（4）:39—41［趙紅霞，周萌，詹勇，等.重金屬對水生動物毒性的研究進展.中國獸醫(yī)雜志，2004，40（4）:39—41］

［5］Deng S P，Zhao Y T，Zhu C H，et al.Effect of cadmium on the antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation in Sanguinolaria acuta［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2012，38（4）:689—695［鄧思平，趙云濤，朱春華，等.鎘對尖紫蛤抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化的影響.水生生物學(xué)報，2012，38（4）:689—695］

［6］Kim J H，Rhee J S，Lee J S，et al.Effect of cadmium exposure on expression of antioxidant gene transcripts in the river pufferfish，Takifugu obscurus（Tetraodontiformes）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，Part C，2010，152（4）:473—479

［7］Cao Z M，Yang J.Effect of cadmium at different concentrations on genomic DNA of common carps［J］.Chinese Journal of Applied and Environmental Biology，2010，16（4）:457—461［曹哲明，楊健.不同濃度Cd2+對鯉魚基因組DNA的影響.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16（4）:457—461］

［8］Barfield M L，F(xiàn)arris J L，Black M C.Biomarker and bioaccumulation responses of asian clams exposed to aqueous cadmium［J］.Journal of Toxicology and Environmental Health，2001，63（7）:495—510

［9］Chen X X，Gao Y T，Wu H X，et al.Changes of digestive enzyme activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium and copper［J］.Acta Ecologica Sinica，2013，33（24）:7690—7698［陳肖肖，高業(yè)田，吳洪喜，等.重金屬Cd2+和Cu2+脅迫下泥蚶消化酶活性的變化.生態(tài)學(xué)報，2013，33（24）:7690—7698］

［10］Lei F，Zhang R C，Chen X Y，et al.Pollution assessment and evaluation of heavy metals in the sea water and surface sediments of Guangxi Beibu gulf coast in summer［J］.Ocean Technology，2013，32（2）:94—102［雷富，張榮燦，陳憲云，等.夏季廣西北部灣近岸海域海水和表層沉積物中重金屬污染現(xiàn)狀及評價.海洋技術(shù)，2013，32（2）:94—102］

［11］Zhou Y X，Zhang Z S.Aquatic Toxicity Test Method［M］.Beijing:Agriculture Press.1989，11—27［周永欣，章宗涉.水生生物毒性實驗方法.北京:農(nóng)業(yè)出版社.1989，11—27］

［12］Wang Z Z，Lü G T，Shi J J，et al.Acute toxic effects of four heavy metals on Trionyx sinensis juveniles［J］.Oceanologia et Limnologia Sinica，2009，40（6）:745—752［王志錚，呂敢堂，施建軍，等.4種重金屬離子對中華鱉稚鱉的急性致毒效應(yīng).海洋與湖沼，2009，40（6）:745—752］

［13］Li W Y，Kang X J，Mu S M，et al.Research advance of toxicological effects of cadmium on shrimps and crabs［J］.Fisheries Science，2008，27（1）:47—50［李文艷，康現(xiàn)江，穆淑梅，等.鎘對蝦蟹毒性效應(yīng)的研究進展.水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（1）:47—50］

［14］Ou X B，Li H Y，Chen Y H，et al.Toxicity and toxic effects of heavy metals cadmium and copper on Hydra sp.［J］.Environmental Pollution and Control，2006，28（8）:584—588［歐小兵，李海云，陳永煌，等.銅、鎘對水螅的急性和聯(lián)合毒性作用.環(huán)境污染與防治，2006，28（8）:584—588］

［15］Yang F，Zou R.Acute toxicity of three heavy metals to yellow catfish Pelteobagrus vachelli［J］.Fisheries Science，2008，27（7）:368—369［楊帆，鄒容.3種重金屬對瓦氏黃顙魚的急性毒性試驗.水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（7）:368—369］

［16］Yang L H，F(xiàn)ang Z Q，Zheng W B.Safety assessment and acute toxicity of heavy metals to crucian Carassius auratus［J］.Journal of South China Normal University（Natural Science），2003，（2）:101—106［楊麗華，方展強，鄭文彪.重金屬對鯽魚的急性毒性及安全濃度評價.華南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，（2）:101—106］

［17］Wang G Y，Hu X M，Zhou Q X，et al.SOD effect of cadmium chloride on acute toxicity of grass carp［J］.Journal of Northeastern University（Natural Science），2007，28（12）:1758—1761［王桂燕，胡筱敏，周啟星，等.鎘對草魚的急性毒性效應(yīng)及SOD的影響.東北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，28（12）:1758—1761］

［18］Song W Y，Jin G S，Bi W W，et al.Studies on acute toxicity of five heavy metal Ions on Porcambarus clarkia girard［J］.Acta Laser Biology Sinica，2010，19（2）:206—211［宋維彥，靳桂雙，畢偉偉，等.五種重金屬離子對克氏原螯蝦（Procambarus clarkiai）的急性毒性作用研究.激光生物學(xué)報，2010，19（2）:206—211］

［19］Chen X X，Wu W J，Lin L L.Toxicity and toxic effects of heavy metals cadmium and zinc on Meretrix meretrix［J］.Jiangsu Agricultural Sciences，2014，42（7）:241—244［陳細香，吳文杰，林玲玲.重金屬Cd、Zn對文蛤的急性毒性和聯(lián)合毒性.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（7）:241—244］

［20］Li Y H，Lin H.Acute toxicity of cadmium to Argopecten irradiams［J］.Marine Fisheries Research，2006，27（6）:80—83［李玉環(huán)，林洪.鎘對海灣扇貝的急性毒性研究.海洋水產(chǎn)研究，2006，27（6）:80—83］

［21］Wang X Y，Wang Q，Yang H S.Acute toxicities of Cd2+and Hg2+on Mactra veneriformis reeve［J］.Marine Sciences，2009，33（12）:24—29［王曉宇，王清，楊紅生.鎘和汞兩種重金屬離子對四角蛤蜊的急性毒性.海洋科學(xué)，2009，33（12）:24—29］

［22］Tanhan P，Sretatugsa P，Pokethitiyook P，et al.Histopathological alterations in the edible snail，Babylonia areolata（spotted babylon），in acute and subchronic cad- mium poisonings［J］.Environmental Toxicology，2005，20（2）:142—149

［23］Chen X X，Lu C Y，Ye Y.Acute toxicity of zinc，lead and cadmium to Phascolosoma esculenta［J］.Marine Environmental Science，2007，26（5）:455—457［陳細香，盧昌義，葉勇.重金屬Zn、Pb和Cd對可口革囊星蟲的急性毒性作用.海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26（5）:455—457］

［24］Wu H，Xuan R，Li Y，et al.Effect of cadmium exposure on digestive enzymes，antioxidant enzymes，and lipid peroxidation in the freshwater crab Sinopotamon henanense［J］.Environmental Science and Pollution Research，2013，20（6）:4085—4092

［25］Eilchiro O.Toxicity of heavy metals and biological defense［J］.Journal of Chemical Education，1995，72（6）:479—483

［26］Kuzmina V V，Golovanova I L，Koyalenko E.Separate and combined effects of cadmium，temperature and pH on digestive enzymes in three freshwater teleosts［J］.Bulletin Environmental Contamination Toxicology，2002，69（2）:302—308

［27］Lai Y H，He B Y，F(xiàn)an H Q，et al.Effects of cadmium stress on the activities of antioxidant enzymes，digestive enzymes and the membrane lipid peroxidation of the mangrove mud clam Geloina coaxans（Gmelin）［J］.Acta Ecologica Sinica，2011，31（11）:3044—3053［賴廷和，何斌源，范航清，等.重金屬Cd脅迫對紅樹蜆的抗氧化酶、消化酶活性和MDA含量的影響.生態(tài)學(xué)報，2011，31（11）:3044—3053］

［28］Zhang Y J，Ni X Y，Ying X P.Combined and isolated effects of zinc ions and cadmium on digestive enzyme activities in hepatopancreas of Cyclina sinensis［J］.Journal of Applied Oceanography，2013，32（1）:88—94［張雨潔，倪小英，應(yīng)雪萍.Zn和Cd單獨及聯(lián)合作用對青蛤肝胰腺消化酶活性的影響.應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報，2013，32（1）:88—94］

［29］Klaassen C D，Liu J，Choudhuiri S.Metallothionein:An intracellular protein to protect against cadmium toxicity［J］.Annual Review of Pharmacology and Toxicology，1999，39（39）:267—294

［30］Xie C，Wu J W，Liu L Y，et al.Effects of multigenerational cadmium stress on cadmium and free amino acid in hemolymph of the Musca domestica larvae［J］.Journal of Environment and Health，2013，30（10）:865—868［謝春，吳建偉，劉利亞，等.多代鎘脅迫對家蠅幼蟲血淋巴中鎘和游離氨基酸的影響.環(huán)境與健康雜志，2013，30（10）:865—868］

［31］Wu F B，Chen F，Wei K，et al.Effect of cadmium on free amino acid，glutathione and ascorbic acid concentrations in two barley genotypes（Hordeum vulgare L.）differing in cadmium tolerance［J］.Chemosphere，2004，57（6）:447—454

［32］Wang L，Pan L Q，Xu C Q，et al.Combination effects of cadmium and benzo［α］pyrene on acute toxicity and metabolic enzymes activities of Ruditapes philippinarum［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2011，35（1）:37—44［王琳，潘魯青，徐超群，等.Cd2+-B［a］P復(fù)合污染對菲律賓蛤仔急性毒性和解毒代謝酶活力的影響.水生生物學(xué)報，2011，35（1）:37—44］

CHANGES OF DIGESTIVE ENZYME ACTIVITIES AND FREE AMINO ACIDS IN SIPUNCULUS NUDUS COELOMIC FLUID UNDER ACUTE STRESS OF CD2+

DONG Lan-Fang，ZHANG Qin，ZENG Meng-Qing，XU Ming-Zhu and TONG Tong
（Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi，Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，China）

Abstract:The current study investigated the acute toxicity of Cd2+to Sipunculus nudus Linnaeus using toxicological methods.To do this，the peanutworms were exposed to Cd2+stress for 48h at minimum lethal concentration，and the dynamic changes of digestive enzyme activities and free amino acids in their coelomic fluid were analyzed.The results showed that the mortality of peanutworms increased with the increasing Cd2+concentration.The LC50of Cd2+after 24h and 48h were 37.80 mg/L and 22.68 mg/L，respectively.Cd2+exposure had inhibitory effects on protease and amylase activities in coelomic fluid during the whole experimental period.The lipase activity increased（P<0.05）at the early time of the exposure，but inhibited significantly（P<0.05）after 24h.The content and composition of free amino acids in coelomic fluid of peanutworms had significant changes during the 48 hours.Each free amino acid and the total amino acid had no significant changes（P>0.05）at the first 24 hours，and then the contents of that increased significantly（P<0.05）and decreased significantly later at the next 24 hours（P<0.05）.The total amino acid reached 145.50 mg/ 100 mL at 36h，twice as initial level.The free amino acids composition had a similar regulation pattern with total amino acid.No significant change was observed at first 24h and then reached peak level after that.The results suggest that acute stress of Cd2+significantly impact digestive enzyme activities and free amino acids in Sipunculus nudus coelomic fluid with a time-dependent pattern.

Key words:Sipunculus nudus； Cadmium； Coelomic fluid； Digestive enzyme activities； Free amino acid

中圖分類號：Q958.11

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0524-08

doi:10.7541/2016.70

收稿日期：2015-07-08；

修訂日期：2015-12-11

基金項目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題（桂科合1346011-12，桂科攻14121006-2-12，桂科合14125008-2-20）； 廣西自然科學(xué)基金（2015 GXNSFBB139005）； 國家自然科學(xué)基金項目（31402304）資助［Supported by Science and Technology Development Program of Guangxi Zhuang Autonomous Region（1346011-12； 14121006-2-12； 14125008-2-20）； Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region（2015GXNSFBB139005）； National Natural Science Foundation of China（31402304）］

作者簡介：董蘭芳（1987—），女，浙江金華人； 本科，助理研究員； 研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)生理與養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)。E-mail:0xiao0dong0@163.com

通信作者：張琴，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師； E-mail:zhangqin821220@163.com