蕭文慧　宋俊威　黃小玲　周玉萍　田長(zhǎng)恩

【摘 要】本文首先以擬南芥IQM4基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，檢索了兩個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索到IQM4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答，并對(duì)IQM4基因表達(dá)量進(jìn)行了分析；然后參考數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的實(shí)驗(yàn)方法，采用半定量RT-RCR技術(shù)驗(yàn)證了幾種非生物脅迫對(duì)IQM4基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明鹽和滲透脅迫均能抑制幼苗期IQM4基因表達(dá)，而脫水、低溫和機(jī)械損傷早期能增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)初步證明擬南芥IQM4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】擬南芥；IQM4；非生物脅迫；基因表達(dá)

在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Ca2+作為動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，通過(guò)Ca2+傳感蛋白及其靶蛋白來(lái)調(diào)節(jié)多種生化和細(xì)胞反應(yīng)。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）是目前最重要的一類胞內(nèi)Ca2+信號(hào)受體。在眾多的CaMs中，除CaM7具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性外，其它均無(wú)任何酶活性，必需與其下游的靶蛋白—鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein， CaMBP）來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[1]。

植物中有5個(gè)含IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族：IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA，其中IQM家族由我們發(fā)現(xiàn)[2]。擬南芥IQM家族共有6個(gè)成員，均含1個(gè)IQ基序，N-端具有與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A的同源序列，C-端具有與天花粉素的同源序列。IQM1編碼1個(gè)Ca2+不依賴型的CaMBP，影響保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，在氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，IQM1缺失抑制了光誘導(dǎo)的氣孔張開(kāi)，iqm1突變體表現(xiàn)氣孔開(kāi)度小和根較短的表型[3]；IQM1過(guò)表達(dá)株系則表現(xiàn)為氣孔開(kāi)度大和根較長(zhǎng)[4]。IQM4（編號(hào)為At2g26190）是IQM家族中與IQM1高度同源的成員[5]，其功能未見(jiàn)報(bào)道。為了研究IQM4的基因功能，本文以IQM4基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，檢索了兩個(gè)生物資源信息數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索到IQM4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答；為了驗(yàn)證生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中IQM4基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，本文開(kāi)展了鹽、甘露醇、脫水、低溫以及損傷處理對(duì)IQM4基因表達(dá)影響的分析，該研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展IQM4基因的功能研究提供重要理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia（Col）生態(tài)型。MS鹽購(gòu)自Sigma公司，PrimeScript One Step RT-PCR Kit，RNAiso Plus購(gòu)自TaKaRa公司，NaCl和Manntiol試劑購(gòu)于上海生工。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 擬南芥培養(yǎng)

土壤培養(yǎng)：將經(jīng)過(guò)4℃浸泡3d的吸漲種子直接點(diǎn)種于營(yíng)養(yǎng)土表面，置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度為22±2℃，光周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為100μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為85%，下同）。

1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)：取經(jīng)過(guò)4℃浸泡3d的吸漲種子，用75%乙醇浸泡5～10s后棄乙醇，再加入0.1% HgCl2浸泡5min后棄HgCl2，用無(wú)菌水漂洗3～4次。最后加入適量的0.3% Agar溶液懸浮，接種到1/2MS培養(yǎng)基上，置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

2.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索

以IQM4基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，檢索AtGenExpress Visualization Tool（http：//jsp.weigelworld.or）和Genevestigator Expression Data（https：//www.genevestigator.com），以基因表達(dá)改變量為1.5倍為閾值，篩選對(duì)IQM4基因表達(dá)影響較大的非生物因素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

2.3 非生物脅迫的處理

滲透脅迫處理：將1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，稱取30～50mg幼苗為一個(gè)樣品，共稱取6個(gè)樣品；將樣品浸沒(méi)于300mmol/L甘露醇溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。

鹽脅迫處理：稱取6個(gè)2周幼苗樣品，將樣品浸沒(méi)于150mmol/L氯化鈉溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。

低溫處理：稱取3個(gè)2周幼苗樣品；將樣品置于4℃處理，分別在0.5、1和3h取樣。

脫水處理：稱取3個(gè)2周幼苗樣品；將樣品放在濾紙上，并置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中，分別在0.5、1和3h取樣。

損傷處理：先用帶有鋸齒的鑷子夾傷生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的2周幼苗，然后置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中，分別在0.25和0.3h取樣。

2.4 IQM4基因的RT-PCR分析

參照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取非生物脅迫處理的樣品總RNA。

以IQM4編碼序列的特異引物F1：5-AGTTAGCTC TTCAGCATTGGC-3′和R1：5-TCTTCTTGTTCCTCTGTAACG-3′進(jìn)行半定量RT-PCR，分析樣品中IQM4的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)以擬南芥β-ATPase基因設(shè)計(jì)了內(nèi)標(biāo)引物F2：5-CTGAATCAATCTCTTAAGCTG-3和R2：5-GTGCAGA AAGTTCTACAGAACTAC-3。RT-PCR采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit，每個(gè)反應(yīng)以100 ng總RNA為模板，總反應(yīng)體積為20 μL，擴(kuò)增參數(shù)為①50℃ 30min，②94℃ 2min，③94℃ 30s，④54℃ 30s，⑤72℃ 40s，③④⑤ 31次循環(huán)，⑥72℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

3 結(jié)果與分析

3.1 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中IQM4基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

本文以擬南芥IQM4為研究對(duì)象，檢索了兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索到大量IQM4基因表達(dá)的數(shù)據(jù)資料。表1是以IQM4表達(dá)量改變倍數(shù)在1.5倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，整理了幼苗地上組織中IQM4基因表達(dá)受到鹽和滲透脅迫、低溫、脫水以及機(jī)械損傷等非生物脅迫因子影響的數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)庫(kù)的資料（表1）來(lái)分析，鹽脅迫1h后明顯抑制了幼苗地上組織中IQM4基因表達(dá)；滲透脅迫在0.5～1h內(nèi)顯著增強(qiáng)了IQM4基因表達(dá)量，但3～24h內(nèi)基因表達(dá)變化不明顯；低溫脅迫0.5h內(nèi)IQM4基因表達(dá)量有所下調(diào)；脫水和機(jī)械損傷能迅速增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)量。

3.2 幼苗中IQM4基因的RT-PCR分析

采用半定量RT-PCR技術(shù)分析幾種非生物脅迫對(duì)擬南芥幼苗中IQM4基因表達(dá)的影響。

從圖1A可以看出，與對(duì)照相比，鹽脅迫初期（0.5和1h），IQM4基因表達(dá)明顯上調(diào)，隨著鹽脅迫時(shí)間的增加（6和12h），IQM4表達(dá)量顯著降低，但24h后表達(dá)量恢復(fù)到對(duì)照水平。圖1B顯示，與對(duì)照相比較，滲透脅迫0.5～12h期間IQM4表達(dá)量逐漸降低，至24h時(shí)表達(dá)量有所增加，但仍低于對(duì)照水平。圖1C顯示脫水處理能增強(qiáng)幼苗中IQM4基因表達(dá)量。圖1D顯示低溫處理后，IQM4表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低（0.5～1h）后升高（3h）趨勢(shì)，低溫處理3h后IQM4表達(dá)量明顯高于對(duì)照。圖1E顯示幼苗遭受機(jī)械損傷0.25h后，IQM4基因表達(dá)稍有增強(qiáng)，而0.5h后，IQM4基因的表達(dá)量急劇降低。從RT-PCR結(jié)果來(lái)看，不同脅迫因子對(duì)幼苗中IQM4基因表達(dá)水平產(chǎn)生了不同影響。

4 討論

已知擬南芥IQM家族在植物對(duì)光、生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。半定量RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證了生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的資料，結(jié)果表明擬南芥IQM4基因表達(dá)受到鹽和滲透脅迫、脫水、低溫和機(jī)械損傷等非生物脅迫因子的影響，初步證明IQM4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RT-PCR分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)有部分偏差，如鹽脅迫處理RT-PCR結(jié)果是脅迫0.5h和1h后IQM4基因表達(dá)明顯上調(diào)，而數(shù)據(jù)庫(kù)的資料則為脅迫1h后IQM4表達(dá)量顯著降低。RT-PCR結(jié)果顯示滲透脅迫明顯抑制IQM4表達(dá)，而數(shù)據(jù)庫(kù)的資料則為滲透脅迫0.5h和1h后顯著增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)量。數(shù)據(jù)庫(kù)的資料顯示機(jī)械損傷明顯增強(qiáng)IQM4表達(dá)水平，但RT-PCR結(jié)果則是表達(dá)水平有所下降。我們推測(cè)RT-PCR結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)的資料出現(xiàn)偏差的原因可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料的取樣部位不一致造成的，數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的取材為幼苗地上組織，而本實(shí)驗(yàn)是以整株幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。

【參考文獻(xiàn)】

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[2]田長(zhǎng)恩，周玉萍.植物具IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48（4）：447-460.

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[4]周玉萍，陳瓊?cè)A，陳潔珊，程惠貞，田長(zhǎng)恩.IQM1基因過(guò)量表達(dá)對(duì)擬南芥氣孔運(yùn)動(dòng)及根系生長(zhǎng)的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（5）：904-910.

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[責(zé)任編輯：楊玉潔]