曹會(huì)杰　劉春芳　程艷梅　張秀蓮　王宏偉　朱生樑△（.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上?！?000；.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海　00437）

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疏肝和胃方對(duì)胃食管反流大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1表達(dá)的影響*

曹會(huì)杰1劉春芳2程艷梅2張秀蓮2王宏偉2朱生樑2△
（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200002；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200437）

【摘要】目的觀察疏肝和胃方對(duì)胃食管反流大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中內(nèi)臟敏感因子瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）表達(dá)的影響，探討其治療胃食管反流病的機(jī)理。方法將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、中藥組及西藥組，每組10只，除正常組外均行賁門肌切開(kāi)術(shù)加幽門半結(jié)扎術(shù)制備反流性食管炎模型，并分別給予相應(yīng)干預(yù)措施。免疫組化法及實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（QPCR）方法觀察各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1受體及TRPV1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，模型組、西藥組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1陽(yáng)性表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；中藥組與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與西藥組比較，中藥組TRPV1陽(yáng)性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。模型組背根神經(jīng)節(jié)組織中TRPV1 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組、中藥組及西藥組（P＜0.05）；中藥組、西藥組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中藥組與西藥組比較，兩組背根神經(jīng)節(jié)組織中TRPV1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論疏肝和胃方可能通過(guò)抑制TRPV1過(guò)度表達(dá)來(lái)發(fā)揮其治療胃食管反流病的作用。

【關(guān)鍵詞】胃食管反流病反流性食管炎瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）疏肝和胃方

胃食管反流病是指胃內(nèi)容物反流入食管、口腔（包括喉部）或肺所致的癥狀和（或）并發(fā)癥［1］。目前認(rèn)為，內(nèi)臟敏感因子瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）在胃食管反流病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。食管炎患者TRPVl在食管乳頭部的表達(dá)與反酸等癥狀顯著相關(guān)［2］。疏肝和胃方（柴胡、枳殼、旋覆梗、代赭石、香附、煅瓦楞、延胡索、太子參、黃連、吳茱萸、甘草）是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃食管反流病?？崎T診長(zhǎng)期應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方，其治療胃食管反流病臨床效果顯著［3］。本研究觀察了疏肝和胃方對(duì)胃食管反流大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)TRPV1受體及TRPV1 mRNA表達(dá)的影響，以闡述其治療胃食管反流病的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠40只，健康雄性，體質(zhì)量（250±20）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司生產(chǎn)（動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002）。常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2試劑與儀器兔抗TRPV1一抗、羊抗兔IgG二抗、DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；0.5%伊紅、蘇木素、二甲苯、梯度酒精由上海市制藥七廠生產(chǎn)；0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、3%過(guò)氧化氫由上海天賀生物有限公司提供；微量樣本RNA提取試劑盒（DP420）、DEPC H2O（750024）、逆轉(zhuǎn)錄酶（R250-01）、熒光染料SYBR Green I（CS7561）、Rnase Inhibitor （E00381）、oligodT/Randomprimer/特異性引物、100 mM dNTPs（18427 013）、Platinum Taq DNA Polymerase均購(gòu)自Invitrogen公司。半自動(dòng)脫水機(jī)TP1020（Leica）、全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)EG1150（Leica）、全自動(dòng)石蠟切片機(jī)RM2235（Leica）、光學(xué)顯微鏡H550S（Nikon Eclipse 50 i）、計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（IPWIN60）、高速冷凍離心機(jī)Neofuge13R（Heal Force）、生物安全柜HFsafe 1200 A2 （Heal Force）、熒光定量PCR儀CFX96TM型（Bio Rad）。疏肝和胃方藥物組成：旋覆梗12 g，代赭石15 g，柴胡9 g，枳殼12 g，香附9 g，煅瓦楞30 g，延胡索9 g，太子參9 g，黃連3 g，吳茱萸3 g，甘草6 g。采用中藥顆粒劑（由本院藥劑科提供），使用前配成溶液。奧美拉唑膠囊（由常州四藥生產(chǎn)，批號(hào)20130320，規(guī)格為20 mg/粒），使用前配成溶液。

1.3分組與造模40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、中藥組及西藥組，每組10只。除正常組外，其余3組大鼠均參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道行賁門肌切開(kāi)術(shù)加幽門半結(jié)扎術(shù)復(fù)制胃食管反流病模型［4-5］。

1.4給藥方法造模后1周，中藥組予疏肝和胃方顆粒劑，用前將顆粒劑配制成0.641 g/mL混懸液；西藥組予奧美拉唑膠囊，用前配制成0.208 mg/mL混懸液；每次按1 mL/100 g體質(zhì)量，每日2次灌胃，連續(xù)14 d。模型組和正常組予等量0.9%氯化鈉注射液。各組于造模后第22日處死。

1.5觀察方法處死大鼠后，充分暴露胸椎段脊髓，將脊神經(jīng)后段及其出椎管處膨大呈串珠樣的背根神經(jīng)節(jié)取下，一部分置于4%多聚甲醛中，一部分儲(chǔ)存于-80℃冰箱。1）免疫組化法檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1受體的表達(dá)。背根神經(jīng)節(jié)置于4%多聚甲醛中4℃冰箱固定2 h；PBS沖洗3次；將組織塊浸入含20%蔗糖的PBS液4℃過(guò)夜，第2日包埋、冰凍切片，37℃溫箱30 min；常規(guī)二甲苯，乙醇脫蠟至水，PBS洗3×3 min；用0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（pH6.0），煮沸熱修復(fù)（95℃15 min），保溫15 min，室溫自然冷卻，PBS洗3×3 min；3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫孵育10 min；PBS洗3×3 min；10%正常胎牛血清室溫孵育30 min；PBS洗3×3 min；一抗4℃孵育過(guò)夜；PBS洗3×3 min；二抗37℃孵育1.5 h；PBS洗3×3 min；DAB顯色3～5 min；蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化1 s；脫水吹干后，樹(shù)脂封片。2）圖像分析。使用IPWIN60圖像分析系統(tǒng)。在Nikon光學(xué)顯微鏡高倍鏡（×400）下每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，并采集圖像，測(cè)定一定面積內(nèi)，免疫組化圖像中陽(yáng)性區(qū)域面積比以及光密度值（Optical Density）。免疫組化陽(yáng)性指數(shù)=陽(yáng)性面積比×平均光密度。3）QPCR法檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1 mRNA表達(dá)。采用Tiangen公司DP420試劑盒進(jìn)行RNA抽提，取50 μg左右組織，加入1 mL Trizol液，充分勻漿；22℃，靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，顛倒15 s；22℃，靜置3 min；4℃×14000轉(zhuǎn)/min×15 min離心，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL異丙醇，混勻；22℃，靜置10 min；4℃×14000轉(zhuǎn)/min×10 min離心，棄上液，加入1 mL 4℃75%乙醇；4℃×10000轉(zhuǎn)/min× 5 min離心，棄上液，真空干燥5 min；用40 μL DEPC處理水溶解，-80℃保存。引物參照GenBank序列。RAT TRPV1上游引物5’-CGGTGGTGACGCTGATTG AAGAC-3’，下游引物5’-GTTGAGCA GGAGGATGTA GGTGAGA-3’，擴(kuò)增片段177 bp采用熒光染料SYBR Green（CS7561）嵌合熒光法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，儀器采用CFX96TM型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。PCR反應(yīng)條件為95℃10 s；95℃5 s；60℃20 s，40個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCT法加以分析，以ddH2O作為陰性對(duì)照，樣本的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。符合正態(tài)分布以（x±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析，如不符合正態(tài)分布或方差齊性則采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1陽(yáng)性表達(dá)比較見(jiàn)表1，圖1。免疫組化結(jié)果顯示，TRPV1陽(yáng)性表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜內(nèi)，而細(xì)胞核無(wú)明顯表達(dá)。與正常組相比，模型組、西藥組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1陽(yáng)性表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；中藥組與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；西藥組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與西藥組比較，中藥組TRPV1陽(yáng)性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1陽(yáng)性表達(dá)比較（x±s）

圖1　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1表達(dá)免疫組化圖（蘇木素，×400）

2.2各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1 mRNA表達(dá)比較見(jiàn)表2。正常組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中含有少量的TRPV1 mRNA表達(dá)。模型組背根神經(jīng)節(jié)組織中TRPV1的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組、中藥組及西藥組（P＜0.05）；中藥組、西藥組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且中藥組與西藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1 mRNA表達(dá)比較（x±s）

3　討論

TRPV1是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，主要表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)中，也分布于胃腸道中，主要存在于傷害感受器上，參與炎性、機(jī)械性和溫度性的痛覺(jué)發(fā)生和痛覺(jué)過(guò)敏形成［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)TRPV1參與了食管神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生，與P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽的釋放有關(guān)［8］。將人食管上皮細(xì)胞培養(yǎng)于酸化的細(xì)胞培養(yǎng)基中，模擬胃食管反流病中食管黏膜的酸暴露，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中TRPV1 mRNA及其蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞中巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1等趨化因子的表達(dá)也相應(yīng)增加，而應(yīng)用TRPV1拮抗劑后趨化因子表達(dá)明顯降低［9］，這提示在食管酸暴露的情況下，TRPV1激活后會(huì)促進(jìn)趨化因子釋放，進(jìn)而加重食管黏膜炎癥。當(dāng)食管黏膜長(zhǎng)期暴露于酸環(huán)境中，食管內(nèi)pH下降，進(jìn)而激活了食管黏膜及周圍神經(jīng)中的酸敏感離子通道，沿傳入神經(jīng)傳至中樞神經(jīng)，引起背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1的開(kāi)放，TRPV1可將化學(xué)刺激、機(jī)械刺激等多種傷害性信號(hào)整合，尤其對(duì)痛覺(jué)信號(hào)更為敏感，TRPVl的開(kāi)放導(dǎo)致痛覺(jué)閾值的降低，進(jìn)一步導(dǎo)致傷害感受器興奮性升高，最終大腦中樞對(duì)感覺(jué)閾值進(jìn)行下調(diào)，沿傳出神經(jīng)傳出后使得患者對(duì)正常生理刺激或低強(qiáng)度的閾下刺激變得敏感。另外TRPV1激活還可促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥神經(jīng)肽的釋放，加劇炎癥反應(yīng)。本研究中模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的TRPV1含量較正常組明顯增高，從而表明在胃食管反流病的發(fā)病過(guò)程中，TRPV1受體水平的上調(diào)可導(dǎo)致食管高敏化，進(jìn)而加重食管黏膜炎癥反應(yīng)。

胃食管反流病屬于中醫(yī)學(xué)“食管癉”“吐酸”等范疇。疏肝和胃方乃緊切本病肝膽失于疏泄、胃失和降，胃氣上逆的基本病機(jī)組方而成，具有疏肝利膽、通降和胃的功效。方中柴胡、枳殼、代赭石、旋覆梗升降相因，共奏疏肝理氣、和胃降逆之效；黃連、吳茱萸寒熱并用，辛開(kāi)苦降，清降肝胃郁火、制酸和胃；延胡索行氣止痛；香附配合柴胡等加強(qiáng)疏肝解郁，行氣止痛之效；煅瓦楞功在制酸止痛；太子參、甘草健脾養(yǎng)胃、調(diào)和諸藥。諸藥配伍從整體上協(xié)調(diào)各臟腑之間的功能，同時(shí)緊緊圍繞調(diào)節(jié)氣機(jī)，使肝膽脾胃中焦氣機(jī)歸于正常，邪去正安，則諸癥俱消。前期研究顯示，疏肝和胃方治療胃食管反流病具有良好療效［3］，且對(duì)反流性食管炎大鼠模型食管黏膜炎癥具有明顯改善作用［10］，但其作用機(jī)制并不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)在上述基礎(chǔ)上，證明疏肝和胃方對(duì)胃食管反流病大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1的表達(dá)具有一定的調(diào)控作用，通過(guò)抑制TRPV1的高表達(dá)，使被激活或致敏的TRPV1恢復(fù)正常，減少痛覺(jué)的傳導(dǎo)，進(jìn)而改善食管黏膜炎癥。

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Influence of Shugan Hewei Decoction onTRPV1 in Dorsal Root Ganglia of Rats with Reflux Esophagitis

CAO Huijie，LIU Chunfang，CHENG Yanmei，et al.Putuo Central Hospital Affiliated to Shanghai Medicine University，Shanghai 200002，China.

【Abstract】Objective：To observe the influence of Shugan Hewei Decoction on TRPV1 in dorsal root ganglia of rats with reflux esophagitis and explore the mechanism of the treatment of gastroesophageal reflux disease.Methods：Fourty healthy male Spregue-Dawley（SD）rats were randomly divided into 4 groups（n = 10）：the normal group，the model group，TCM group，Western medicine group.Reflux esophagitis models were induced by cardiomyotomy and pylorus semiligation，and given the corresponding intervention measures.Expression of TRPV1 receptors and the expression of TRPV1mRNA in dorsal root ganglia of rats were observed with immunohistochemical method and QPCR.Results：Compared with the normal group，positive expressions of TRPV1 in model group and Western medicine group were significantly higher（P＜0.05）.There was no significant difference between the treatment group and TCM group（P＞0.05）.Compared with Western medicine group，the positive expression of TRPV1 was significantly decreased in TCM group；the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression level of TRPV1mRNA in model group was significantly higher than normal group，TCM group and Western medicine group（P＜0.05）.The difference was not statistically significant between normal group，TCM group and Western medicine group（P＞0.05）.The expression of TRPV1mRNA in the last two groups was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion：The mechanism of Shugan Hewei Decoction on gastroe sophageal reflux disease may inhibitting the overexpression of TRPV1.

【Key words】Gastroesophageal reflux disease；Reflux esophagitis；Transient receptor potential cation channel 1；Shugan Hewei Decoction

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0623-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.017

*基金項(xiàng)目：國(guó)家中醫(yī)藥管理局“十二五”重點(diǎn)?？祈?xiàng)目（No.09JIX1L206B118）；上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院科研基金項(xiàng)目（No.30304115238）

通信作者△（電子郵箱：lef2_hb@163.com）

收稿日期（2015-12-02）