徐佑?xùn)|，張艷，孟憲麗，曾勇，王平

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基于反向?qū)臃ǖ狞S連堿抗炎機(jī)制分子模擬研究

徐佑?xùn)|，張艷，孟憲麗，曾勇，王平

［摘要］目的：基于分子反向?qū)蛹夹g(shù)，以黃連堿為研究對(duì)象，對(duì)TLR4/NF-κB、p38、JAK2/STAT3 3條通路上的蛋白進(jìn)行反向篩選，以篩選出黃連堿的炎癥靶標(biāo)蛋白。方法：獲取Toll樣受體4/核因子（TLR4/NF-κB）、p38 促分裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK） 和Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK2/STAT3）3條炎癥通路上的30個(gè)蛋白的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)以及黃連堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)；利用AutoDockTools對(duì)所有蛋白的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；AutoGrid對(duì)蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行格子計(jì)算；利用AutoDock對(duì)黃連堿進(jìn)行反向?qū)幽M實(shí)驗(yàn)；根據(jù)對(duì)接結(jié)果自由能高低進(jìn)行排序，篩選出親和力高的靶蛋白；對(duì)篩選得到的靶蛋白進(jìn)行作用力分析并作圖。結(jié)果：反向篩選得到4個(gè)與黃連堿具有高親和性的靶蛋白，4個(gè)靶蛋白分別為PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα。結(jié)論：黃連堿對(duì)PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα靶蛋白具有競(jìng)爭(zhēng)抑制的活性，提示黃連堿可以通過(guò)抑制該4個(gè)靶蛋白進(jìn)而阻礙炎癥信號(hào)傳遞，影響下游蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。

［關(guān)鍵詞］黃連堿；分子對(duì)接；JAK2/STAT3通路；TLR4/NF-κB通路；炎癥；AutoDock

［作者單位］成 都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

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黃連堿是毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch）中的有效成分，其屬于原小檗堿型生物堿季銨鹽，并具有良好的抗內(nèi)毒素和抗炎作用［1，2］。研究顯示黃連堿能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA的表達(dá)水平升高，下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-8表達(dá)量［3～4］。雖然，眾多實(shí)驗(yàn)表明黃連堿具有抗炎作用，但是目前的研究?jī)H停留在動(dòng)物以及細(xì)胞階段，通過(guò)檢測(cè)炎癥因子或某些蛋白表達(dá)量的高低來(lái)評(píng)價(jià)黃連堿的抗炎效果。而黃連堿在TLR4/NF-κB通路上特異性結(jié)合的靶蛋白，并通過(guò)抑制靶蛋白，阻斷炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制性研究卻鮮有報(bào)道，這也導(dǎo)致黃連堿直接以及間接作用的靶蛋白不夠明確。因此，有必要在分子水平上對(duì)黃連堿進(jìn)行深入的探究。

在炎癥應(yīng)答過(guò)程，TLR4/NF-κB信號(hào)通路涉及到多條信號(hào)通路的共同參與完成，并能通過(guò)通路間的協(xié)同作用，增強(qiáng)炎癥的應(yīng)答。其中，TLR4/ NF-κB信號(hào)通路、JAK激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase 2/ signal transducer and activatorof transcription 3， JAK2/STAT3）以及P38絲裂原激活蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAKP）在炎癥應(yīng)答過(guò)程中彼此間聯(lián)系緊密。實(shí)驗(yàn)顯示，NF-κB的活化將誘導(dǎo)一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、環(huán)氧酶2 （cyclooxygenase-2， COX-2）、金屬基質(zhì)螯合蛋白酶（matrix metallopeptidase 9， MMP-9）的表達(dá)［5-8］。在LPS刺激下，P38蛋白被激活并遷移進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控NF-κB的表達(dá)，使NF-κB介導(dǎo)的下游蛋白表達(dá)增加［9］。另外，JAK2/STAT3信號(hào)通路也能通過(guò)PI3K/ PDK1/Akt 通路來(lái)調(diào)控NF-κB的表達(dá)，同樣TLR4/ NF-κB信號(hào)通路也可以利用PI3K/Akt/mTOR通路與STAT3協(xié)同作用，促進(jìn)IL-6、IL-10、IL-11、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27等炎癥因子活化［10，11］。因此，完整的黃連堿的抗炎實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行多個(gè)蛋白的活性抑制實(shí)驗(yàn)，從而獲得詳盡蛋白活性抑制信息。

目前，蛋白晶體學(xué)解析、蛋白熒光猝滅以及分子反向?qū)蛹夹g(shù)是驗(yàn)證配體與靶蛋白相互作用的最有效的方法［12-14］。蛋白晶體學(xué)解析對(duì)蛋白純化要求極高而且成本昂貴，因此只能對(duì)單個(gè)明確的靶蛋白展開(kāi)研究。熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，雖然對(duì)蛋白要求較低，但是若進(jìn)行多靶標(biāo)蛋白的驗(yàn)證，將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)量增大，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本過(guò)于高昂。反向?qū)蛹夹g(shù)是目前較為準(zhǔn)確的靶蛋白篩選手段，該技術(shù)以分子對(duì)接技術(shù)作為基礎(chǔ)，對(duì)單個(gè)或者多個(gè)配體進(jìn)行蛋白批量的對(duì)接篩選，再根據(jù)對(duì)接能量高低排序并分析，找出潛在的靶標(biāo)蛋白［15］，反向?qū)蛹夹g(shù)［16，17］可以減少實(shí)驗(yàn)所需靶標(biāo)蛋白數(shù)量提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)也能在保證可信度的基礎(chǔ)上降低實(shí)驗(yàn)成本。基于分子模擬技術(shù)及黃連堿抗炎機(jī)理的研究現(xiàn)狀，本文利用反向?qū)蛹夹g(shù)，對(duì)炎癥通路相關(guān)的30蛋白進(jìn)行反向?qū)?，以篩選出黃連堿的高親和性靶蛋白，并對(duì)黃連堿與靶蛋白進(jìn)行受力分析，以期為黃連堿抗炎機(jī)制以及抗炎新藥的研制提供依據(jù)。

1　材料與方法

本實(shí)驗(yàn)以TLR4/NF-κB、p38、JAK2/STAT3炎癥通路上30個(gè)蛋白為研究對(duì)象（相關(guān)蛋白詳見(jiàn)表1），所有蛋白的晶體結(jié)構(gòu)均從RCSB Protein Data bank （PDB）上PDB格式獲取。晶體結(jié)構(gòu)中的所有雜原子、結(jié)晶水以及本身結(jié)構(gòu)解析時(shí)所攜帶的配體全部去除，并添加極性氫，計(jì)算高斯電荷。以上所有優(yōu)化過(guò)程均在AutoDock Tools-1.5.6rc3軟件上完成。

黃連堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)從PubChem上獲取，文件保存為3D SDF格式。配體結(jié)構(gòu)通過(guò)Swiss-PDB Viewer V.4.02中的GRO-MOS96模塊進(jìn)行MM-2能量?jī)?yōu)化。

將上述處理的蛋白受體作為黃連堿（配體）反向篩選的酶靶。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，配體允許自由旋轉(zhuǎn)。AutoGrid模塊利用對(duì)應(yīng)配體原子（C， N和O）的探針原子在靶點(diǎn)蛋白的活性區(qū)域進(jìn)行探測(cè)并生成勢(shì)能圖。AutoDock選擇拉馬克遺傳算法（Lamarckian Genetic-Algorithm， GA）來(lái)模擬計(jì)算配體與靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)間的親和力。對(duì)接過(guò)程選用半柔性對(duì)接，運(yùn)行次數(shù)為100次，最大能量評(píng)價(jià)為5000000，種群數(shù)量為150，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。

最后，選用PyMOL1.5.0.4 （python molecule，PyMOL） 與 LigPlot+進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

2　結(jié)果

2.1 對(duì)接方法的檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)對(duì)接方法的可靠性，選取4個(gè)晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:2B7A，3HR4，3UVQ，4EZJ）進(jìn)行重復(fù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)。對(duì)接結(jié)果顯示，重復(fù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)的RMSD值均小于2.0?，說(shuō)明重復(fù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)是成功的，對(duì)接方案是可信的。

圖1 重復(fù)對(duì)接結(jié)果，藍(lán)色的配體為晶體結(jié)構(gòu)上的原配體，黃色配體為重復(fù)對(duì)接構(gòu)象，兩個(gè)構(gòu)象疊合對(duì)比顯示。A，2B7A；B，3HR4；C，3UVQ；4，4EZJ

2.2 黃連堿反向?qū)咏Y(jié)果黃連堿與3條炎癥通路靶標(biāo)蛋白的對(duì)接結(jié)果顯示，黃連堿對(duì)蛋白激酶具有更高的親和力，尤其是對(duì)PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα（PDB ID：4EZJ、4ANV、4KIK、4JPS）的ATP催化位點(diǎn)的結(jié)合能力最強(qiáng)，對(duì)接自由能分別為：-9.93、-9.54、-9.44、-9.14 kcal/mol，抑制常數(shù)分別為52.22、101.07、120.47、198.91 nM.L-1。另外，黃連堿與Akt1、Akt2、p38、COX-2、iNOS、PI3Kβ、JAK2、TLR4、TAK1也有較高的親和性，結(jié)合自由能在：-8.00到 -9.00 kcal/ mol之間。

表1 黃連堿與炎癥靶標(biāo)蛋白對(duì)接數(shù)據(jù)

7　Akt2 ATP位點(diǎn)　100　-8.68 　431.16 nM.L-18　P38 脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)　100　-8.62 　477.21 nM.L-19　COX-2　84　-8.43 　660.2 nM.L-110　iNOS 還原區(qū)域　99　-8.41 　682.32 nM.L-111　PI3Kβ ATP位點(diǎn)　100　-8.37 　782.71 nM.L-112　iNOS 氧化區(qū)域　100　-8.27 　870.32 nM.L-113　JAK2　100　-8.25 　891.43nM.L-114　TLR4　100　-8.25 　899.4 nM.L-115　TAK1 ATP位點(diǎn)　100　-8.01 　1.35 μM.L-116　IRAK4 ATP位點(diǎn)　19　-7.87 　1.7 μM.L-117　MyD88　37　-7.71 　2.24 μM.L-118　TAB1　100　-7.66 　2.43 μM.L-119　MMP-9催化位點(diǎn)　100　-7.55 　2.9 μM.L-120　Akt1 PH位點(diǎn)　75　-7.45 　3.44 μM.L-121　P38 ATP位點(diǎn)　51　-7.35　4.07μM.L-122　TRADD　10　-7.34 　4.14 μM.L-123　TIRAP　85　-7.26 　4.77 μM.L-124　TRAF2　7　-7.13 　5.93 μM.L-125 IRAK4底物結(jié)合位點(diǎn)　15　-6.95 　8.04 μM.L-126　TRAF6　98　-6.87 　9.25 μM.L-127　IKKγ　100　-6.80 　10.31 μM.L-128　Akt3 PH位點(diǎn)　49　-6.67 　12.96 μM.L-129　SHP2催化位點(diǎn)　100　-6.63 　13.74 μM.L-130 MMP-9 底物結(jié)合位點(diǎn)　100　-6.55　15.75μM.L-131　TNFR1　100　-6.36 　21.89 μM.L-132　NF-κB　37　-6.73 　11.69 μM.L-133　Gp130　15　-6.17 　30.22 μM.L-134　IKKβ　85　-5.95 　43.17 μM.L-135　STAT3　28　-5.91 　46.96 μM.L-1

2.3 黃連堿與高親和性鍵靶標(biāo)蛋白作用模式

如圖2，3所示，黃連堿的所含氧原子為氫鍵作用的位點(diǎn)，這些氫鍵為黃連堿與ATP位點(diǎn)間的穩(wěn)定結(jié)合起做出巨大貢獻(xiàn)。由于黃連堿的高度共軛結(jié)構(gòu)，其與PI3Kδ、PI3Kγ、PI3Kα的殘基Lys833、Lys802形成π-cation相互作用，與IKKβ的Tyr96之間產(chǎn)生π-π堆積效應(yīng)。黃連堿與PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα 的ATP位點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合的另一個(gè)作用力——疏水作用，為黃連堿與靶蛋白對(duì)接的主要作用力。如圖3所示，黃連堿與4個(gè)靶蛋白ATP位點(diǎn)的殘基形成疏水作用，并且與活性區(qū)域形成構(gòu)型互補(bǔ)，從而牢牢的結(jié)合在活性位點(diǎn)上。

圖2 黃連堿與PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα的對(duì)接模式圖。

A為黃連堿與PI3Kδ ATP位點(diǎn)的作用模式；B為黃連堿與PI3Kγ ATP位點(diǎn)的作用模式；C為黃連堿與IKKβATP位點(diǎn)作用模式；D為黃連堿與PI3Kα的作用模式在3D示意圖中，靶蛋白以二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，黃連堿以球棍模型顯示，殘基以棍棒模型顯示。

圖3 黃連堿與PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα的受力分析圖。

A為黃連堿與PI3Kδ的受力分析；B為黃連堿與PI3Kγ的受力分析；C為黃連堿與IKKβ的受力分析；D為黃連堿與PI3Kα的受力分析。在平面示意圖中，輻射狀弧形代表疏水作用的殘基，虛線代表氫鍵，球棍模型為黃連堿

3　討論

分子反向?qū)蛹夹g(shù)是基于分子對(duì)接的逆運(yùn)用，其以配體作為研究對(duì)象，蛋白作為靶標(biāo)進(jìn)行靶蛋白的篩選。本實(shí)驗(yàn)選擇TLR4/NF-κB、p38、JAK2/ STAT3 3條通路上的30個(gè)蛋白進(jìn)行反向?qū)印＝Y(jié)果顯示，黃連堿對(duì)PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα靶蛋白具有高親性。

I型PI3K激酶作為NF-κB通路與JAK2/STAT3通路的“交匯”，磷酸化的I型PI3K可以通過(guò)PDK1/Akt通路激活NF-κB并促進(jìn)iNOS的表達(dá)，也可以通過(guò)Akt/ mTOR通路促進(jìn)STAT3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 Wu X等［18］研究發(fā)現(xiàn)，I型PI3K的抑制能夠顯著減少LPS所引起的氧化自由基的產(chǎn)生，并且極大程度上抑制的NF-κB的活化，減少iNOS、MMP-9、COX-2、IL-6、IL-1β表達(dá)，從而緩解炎癥。JAK2/STAT3通路可介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，JAK2的磷酸化可激活STAT3進(jìn)入細(xì)胞核并介導(dǎo)多種炎癥因子生成，I型PI3K的活化能夠促進(jìn)這一炎癥應(yīng)答過(guò)程，增加iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β［19，20］。另外，在LPS/TLR4、PI3K/Akt、p38信號(hào)通路上，NF-κB作為多條信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)，是生成iNOS、COX-2/MMP-9等炎癥因子的關(guān)鍵的靶蛋白。IKKβ作為NF-κB的抑制蛋白，掩蓋了NF-κB的活化區(qū)域，有效的阻止NF-κB的轉(zhuǎn)錄入核，但I(xiàn)KKβ卻可以在ATP的磷酸化作用下活化并暴露NF-κB的活化區(qū)域，導(dǎo)致NF-κB的激活［21］。因此，IKKβ的抑制將能有效的中斷炎癥應(yīng)答過(guò)程。

對(duì)接結(jié)果表明黃連堿與PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα的ATP活性位點(diǎn)間存在高親和性，說(shuō)明黃連堿對(duì)4個(gè)蛋白有競(jìng)爭(zhēng)抑制的活性，這一競(jìng)爭(zhēng)抑制的繼發(fā)效果表現(xiàn)為阻礙TLR4/NF-κB信號(hào)通路，降低NF-κB的活化等作用。并且已有的實(shí)驗(yàn)顯示，黃連堿能夠下調(diào)下游的炎癥因子及核轉(zhuǎn)錄蛋白的表達(dá)量［22，23］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面證實(shí)黃連堿通過(guò)抑制I型PI3K以及IKKβ的磷酸化而發(fā)揮抗炎作用。

能量分析顯示，黃連堿傾向于親和蛋白激酶，如Akt1、Akt2、p38、PI3Kβ、TAK1等。這可能與人類(lèi)激酶的ATP區(qū)域（激酶區(qū)域）都有著序列和結(jié)構(gòu)的高度保守性有關(guān)［24］。在ATP與激酶的結(jié)合過(guò)程中，高度共軛腺嘌呤負(fù)責(zé)與激酶區(qū)域牢固地結(jié)合，而黃連堿母核的高度共軛的特性與腺嘌呤相似，所以黃連堿可以像ATP的腺嘌呤環(huán)一樣的結(jié)合到激酶區(qū)域，并且ATP區(qū)域狹窄的構(gòu)象特點(diǎn)也使得黃連堿可以有效地形成構(gòu)型互補(bǔ)，從而與蛋白激酶結(jié)合阻礙炎癥應(yīng)答，發(fā)揮抗炎作用。

從對(duì)接受力分析，黃連堿的高度共軛結(jié)構(gòu)易與殘基之間形成π-π堆積以及cation-a相互作用，并且黃連堿的環(huán)氧原子是與殘基形成氫鍵作用的位點(diǎn)，這些特征性結(jié)構(gòu)在黃連堿的穩(wěn)定結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這些結(jié)構(gòu)特征提示在設(shè)計(jì)PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα等激酶的抑制劑時(shí)，高度共軛以及環(huán)氧結(jié)構(gòu)可以提高化合物的親和性同時(shí)減少旋轉(zhuǎn)鍵帶來(lái)的空間結(jié)構(gòu)的阻礙，同時(shí)氮原子的整合可以降低氧原子帶來(lái)的原子間的排斥力同時(shí)還可挺高化合物的成藥性。

綜上所述，炎癥通路靶位反向?qū)訉?shí)驗(yàn)表明黃連堿抗炎的直接作用靶蛋白為胞內(nèi)PI3Kδ、PI3Kγ、IKKβ、PI3Kα的高度保守ATP位點(diǎn)。這一結(jié)果為進(jìn)一步明確小檗堿型生物堿的抗炎機(jī)制提供了新的研究側(cè)重點(diǎn)，也為相應(yīng)新型先導(dǎo)化合物合成提供了初步的構(gòu)效關(guān)系指征。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Study on anti-inflammatory mechanism of coptisine based on reverse docking method

XU You-dong， ZHANG Yan，MENG Xian-li， ZENG Yong， WANG Ping // （School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: To investigate the mechanism of anti-inflammation of coptisine via the approach of reverse docking，which was utilized to dock coptisine with proteins in the signal pathways of TLR4/NF-κB， P38 and JAK2/STAT3. Method: 30 proteins of TLR4/NF-κB， P38 and JAK2/STAT3 were obtained from PDB website. The structure of coptisine was obtained from PubChem website. The 30 proteins were processed with standardization disposal of AutoDock tools. Then AutoGrid was utilized to calculate the grids of active sites. The docking results were ranked according to docking energy， for the purpose of selecting the proteins with high affinity for coptisine. The action force of the target protein were analyzed and plotted. Result: 4 target proteins including PI3Kδ， PI3Kγ， IKKβ and PI3Kα were found to interact with coptisine with high affinity. Conclusion: Anti-inflammation of coptisine relates to its function of competitive inhibition of the 4 target proteins， which suggests that the behavior of coptisine results in the obstruction to signal pathways. Finally the purpose of treatment for inflammation has been achieved by this method.

［Key words］Coptisine； molecular docking； pathway of JAK2/STAT3； pathway of NF-κB； inflammation； autoDock

［中圖分類(lèi)號(hào)］R 285.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-018-05

［基金項(xiàng)目］國(guó) 家自然基金資助項(xiàng)目（81274111）

［作者簡(jiǎn)介］徐 佑?xùn)|，碩士在讀，主要從事中藥藥理學(xué)研究

［通訊作者］王 平，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樗幋鷦?dòng)力學(xué)研究

［收稿日期］2016-01-20