成小璐，魏怡冰，魏升華，檀龍顏

（貴陽中醫(yī)學院藥學院，貴州貴陽550002）

羊耳菊種子生活力的最佳測定條件

成小璐，魏怡冰，魏升華＊，檀龍顏

（貴陽中醫(yī)學院藥學院，貴州貴陽550002）

為獲得羊耳菊種子生活力的最佳測定條件，采用四唑染色法，以氯化三苯基四氮唑（TTC）濃度、染色溫度和染色時間為指標，通過正交試驗和響應面試驗對測定條件進行優(yōu)化。結果表明：TTC濃度1.5%、染色溫度40℃、染色時間3h為羊耳菊種子生活力測定的最佳條件，3個檢測指標對種子生活力測定的影響為染色溫度＞染色時間＞TTC濃度。

羊耳菊；種子；生活力；TTC染色法

羊耳菊又名羊耳風（貴州）、山白芷等，為菊科（Compositae）旋覆花屬（Inula）植物羊耳菊〔Inula cappa（Buch.Ham.）DC.〕的根或全草［1］。具有除風散寒、行氣止嘔、止咳定喘、止汗、止瀉、止血、消腫解毒及利濕的功效［2］。羊耳菊分布于四川、云南、貴州、廣西、廣東、江西、福建及浙江等地［1］。近年來，對羊耳菊的研究主要涉及化學成分、藥理學和生藥學方面［3－10］。因為羊耳菊具有良好的抗菌和消炎等藥用價值，所以多種中成藥把羊耳菊作為主要的原料藥，如蓮菊感冒膠囊［11］、甘菊滴丸［12］、菊黃上清含片［13］及貴州百靈藥業(yè)的雙羊喉痹通顆粒等。盡管對羊耳菊化學成分和藥理學等方面進行了諸多研究，但有關羊耳菊引種馴化和人工栽培方面鮮有報道。

隨著市場需求量的增加，對羊耳菊的采挖力度逐年加大，但其野生資源有限，且目前各地尚未有人工種植。因此，對羊耳菊進行引種馴化研究十分必要［14］。而藥用植物種子、種苗的生產(chǎn)是藥材生產(chǎn)的基礎，其質量是藥材產(chǎn)量和品質形成的重要前提和基礎［15］。種子質量對羊耳菊規(guī)?；鸵?guī)范化種植起著關鍵性的作用，發(fā)芽率是檢測種子質量的重要指標，但由于羊耳菊的發(fā)芽試驗時間較長而不能快速得到結果。測定種子生活力可以快速確定種子發(fā)芽能力，是種子生產(chǎn)和貿易的重要技術［16－17］。因此，筆者等對羊耳菊種子發(fā)芽能力的最佳測定條件進行了試驗，為客觀評價羊耳菊種子的發(fā)芽能力，預測其播種量和出苗率提供理論依據(jù)，為其大田播種育苗提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

羊耳菊種子于2014年12月29日采自貴州省安順市西秀區(qū)龍宮片區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院鑒定為羊耳菊的種子，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，憑證標本保存于貴陽中醫(yī)學院藥學院標本館。

試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC）。

1.2 種子預處理

1）浸泡。將經(jīng)觀察到具胚、較飽滿的種子除去冠毛，置于濾紙上，加入蒸餾水，加水量以剛沒過種子為宜，待其吸脹后取出，用刀片切去種子靠近冠毛部位的1／4，置于直徑10cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿按10×10順序放置100粒種子，供染色用。

2）染色。每個培養(yǎng)皿加入不同濃度的TTC溶液，分別置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中避光染色，達到時間后取出種子，用清水沖洗，將種子放在濾紙上，根據(jù)染色面積大小及程度判斷種子生活力。另取100粒種子在沸水中煮10min后取出，染色，作為對照組。每個處理重復3次。

1.3 種子生活力測定適宜條件的試驗

1.3.1 正交試驗 以TTC濃度、染色溫度和染色時間3個直接影響生活力測定結果的因素作為檢測指標，每個因素設置3個水平（表1）。

表1 羊耳菊種子生活力測定條件正交試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

1.3.2 單因素試驗

1）染色溫度 取羊耳菊種子100粒，TTC濃度為0.5%，染色時間為1h，染色溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，測定種子生活力。

2）染色液濃度 取羊耳菊種子100粒，染色溫度為35℃，染色時間為1h，TTC濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，測定種子生活力。

3）染色時間 取羊耳菊種子100粒，染色溫度為35℃，TTC濃度為1.5%，染色時間分別為1h、2h、3h、4h及5h，測定種子生活力。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結果，以染色溫度度（x1）、TTC濃度（x2）、染色時間（x3）3個因素為變量，以種子染色率（y）為響應值。根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗設計原理，設計3因素5水平的響應面試驗（表2）。

表2 羊耳菊種子生活力測定條件響應面試驗的因素及水平Table 2 Factors and levels in Box－Behnken experimental design for seed viability testing of I.cappa

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析軟件采用SPSS16.0和Design Expert 8.0.6軟件，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

由表3可知，羊耳菊種子生活力最高（92%）的處理組合染色溫度40℃，TTC濃度1.0%，染色時間3h；生活力最低（29%）的組合為染色溫度30℃，TTC濃度0.5%，染色時間1h。將所得的數(shù)據(jù)進行方差分析結果（表4）表明，染色溫度差異極顯著，TTC濃度和染色時間均差異不明顯，3個因素對羊耳菊種子生活力測定影響的大小排序為染色溫度＞染色時間＞TTC濃度。

2.2 單因素試驗結果

由圖1看出，染色溫度在25～40℃時，種子的染色率隨溫度升高而升高。但當溫度達到40℃后，隨著溫度升高，種子染色率增加緩慢。因此最佳測定溫度定為40℃左右。羊耳菊種子染色率隨著TTC濃度的增加而升高，當TTC濃度達到1.5%時，種子染色率最高，當濃度再增大時，種子染色率反而降低，因此將最佳測定濃度定為1.5%。染色時間在1～3h時，種子的染色率隨染色時間延長而升高。但當時間達3h后，時間再延長，種子染色率增加緩慢。因此最佳測定時間定為3h左右。

表3 羊耳菊種子生活力測定正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

表4 羊耳菊種子生活力測定正交法試驗的方差分析結果Table 4 ANOVA for orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

圖1 不同染色溫度、TTC濃度和染色時間種子的染色率Fig.1 Dyeing rate with different dyeing temperature，TTC concentration and dyeing time

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 模型的建立 利用Design Expert 8.0.6軟件對表5的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得回歸方程為。對模型進行方差分析（表6），F(xiàn)＝ 80.59，且P＜0.001，模型差異極顯著。模型中決定系數(shù)R2為0.986 4，調整決定系數(shù)RAdj2為0.974 2，表明響應值為89.67%的變化來源于所選變量。模型的變異系數(shù)為5.16%（＜10%），表明試驗有良好的穩(wěn)定性。模型的信噪比為29.406（＞4），表明該模型適用于種子生活力測定指標的優(yōu)化。對模型系數(shù)的顯著性進行檢驗，結果表明和x3對羊耳菊種子生活力測定影響極顯著，各因素及其一次項和二次項對羊耳菊種子生活力測定的影響顯著，且3個因素對種子生活力測定的影響順序為染色溫度＞染色時間＞TTC濃度。

表5 羊耳菊種子生活力測定響應面試驗結果Table 5 Experimental results of Box－Behnken for seed viability testing of I.cappa

2.3.2 響應面分析 響應面圖能直觀體現(xiàn)各兩個因素的交互作用對種子生活力響應值的影響，響應曲面的坡度越陡峭，則表明兩個因素的交互作用對種子生活力測定響應值的影響越顯著。從圖2看出，染色溫度和TTC濃度、染色溫度和染色時間、TTC濃度和染色時間對種子生活力測定可產(chǎn)生影響，這與方程的方差分析結果一致。

表6 羊耳菊種子生活力測定響應面試驗的方差分析結果Table 6 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table for seed viability of I.cappa

圖2 各因素交互作用對生活力測定影響的響應面Fig.2 Response surface of interaction between every two factors on testing seed viability

2.3.3 最佳測定條件確定 經(jīng)過Design Expert8.0.6軟件的分析，羊耳菊種子生活力測定的最佳條件為染色溫度40.84℃，TTC濃度1.578%，染色時間3.15h，在此測定條件下羊耳菊的生活力為98.396 5%。為驗證方法的可行性，采用上述方法測定羊耳菊種子生活力，將其條件改為染色溫度40℃，TTC濃度1.5%，染色時間3h，在此條件下測定生活力進行3組平行試驗，平均生活力為98.05%。該結果與理論預測值相差0.346 5%，充分說明響應面分析法對羊耳菊生活力測定條件進行的優(yōu)化可靠，有實用性。

3 結論與討論

1）盡管不同植物的種子用四唑染色法測定生活力時其適宜的測定條件各不相同，但一般選取TTC濃度、染色溫度和染色時間為檢測指標。如白花前胡種子生活力測定的最佳條件以浸泡時間、TTC溶液濃度、染色溫度和染色時間為檢測指標［18］；測定巨紫荊種子生活力的最佳條件以TTC濃度、染色溫度和染色時間為檢測指標［19］。因此，筆者等以TTC濃度、染色溫度和染色時間為考察因素，測定羊耳菊種子生活力的最佳測定條件。白花前胡［18］和巨紫荊［19］種子生活力測定的最佳條件分別為TTC濃度1g／L、染色溫度35℃、染色16h 和TTC濃度0.1%、染色溫度35℃、染色時間為8h。由此可知，TTC濃度、染色時間和染色溫度的不同都會影響種子生活力的判斷，何伶俐［18］研究得出，染色溫度低于30℃和TTC液濃度高于5g／L時，白花前胡種子不染色或染色情況極差，將溫度設置在35℃左右，TTC液濃度在5g／L以下。凌敏［19］發(fā)現(xiàn)，TTC濃度低于0.10%和染色溫度高于50℃時，巨紫荊種子不染色或者染色情況較差，故將TTC濃度設置高于0.10%，染色溫度低于50℃。本試驗在種子生活力測定前，也對羊耳菊種子生活力的TTC濃度及染色溫度做了簡單對比，結果表明TTC濃度低于0.5%，溫度高于50℃時，羊耳菊種子不染色或染色情況差，因此試驗時將TTC濃度設置高于0.5%，溫度低于50℃。

2）測定種子生活力染色前不同種子切割方法不同。白花前胡種子吸水膨大后取出，用刀片沿種子胚的中心線縱切為兩半［18］。梔子種子［20］用刀片沿種子胚中軸縱切成兩半。益母草種子［21］用刀片在距胚端3／4橫切，帶種胚部分進行染色。本研究中羊耳菊種子細小，胚難以取出，橫切面直徑很小，因此靠近胚端方向1／4縱切，帶種胚部分進行染色。

3）中心復合設計－效應面法是近年來應用較多的一種優(yōu)化方法。優(yōu)化當歸多糖提取工藝時，盛小莉等［22］用正交法，以浸泡時間、加水量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，結果發(fā)現(xiàn)4個因素對結果均無顯著性影響，只能依據(jù)直觀分析結果確定最佳條件；但王艷艷等［23］和紀鵬等［24］分別用效應面法時，均得到4個因素對當歸多糖得率影響均較顯著，并結合回歸方程和響應面結果圖確定最佳工藝條件。此外，在優(yōu)化丹參提取工藝時，李紹林等［25］用正交法，以提取次數(shù)、提取時間、醇濃度和溶媒量作為考察因素，只有提取次數(shù)對提取結果具有顯著性影響；而黃元紅等［26］用效應面法得到4個因素影響均較顯著，并結合回歸方程和響應面結果圖確定最佳工藝條件。效應面法能考察各因素間的相互作用，試驗次數(shù)少，精密度高。將效應值對影響因素作曲面圖，直接讀取，有直觀、精密的優(yōu)點。集數(shù)學和統(tǒng)計學方法于一體使結果更加科學可靠，在藥學應用上成效顯著［27］。但至今未有將此方法應用于種子方面的研究。筆者分別用正交法和效應面法進行數(shù)據(jù)分析，以生活力大小為指標考察羊耳菊種子生活力的最佳測定條件，得到染色溫度40℃、TTC濃度1.5%、染色時間3h為羊耳菊種子生活力測定的最佳條件，且3個因素對種子生活力測定的影響順序為染色溫度＞染色時間＞TTC濃度。與正交設計分析法相比較，響應面分析法在試驗設計和結果表達方面更加優(yōu)良，可作為四唑染色法測定羊耳菊種子生活力的方法。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，1985：271－272.

［2］高宣亮.中藥辭海［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1996：2252－2253.

［3］謝紅剛，張宏武，張 江，等.羊耳菊的化學成分［J］.中國天然藥物，2007，5（3）：193－196.

［4］郭啟雷，楊峻山，劉建勛，等.羊耳菊的化學成分研究（Ⅱ）［J］.中藥材，2007，30（1）：35－37.

［5］楊 雁，王于方，趙 雷，等.羊耳菊的化學成分研究［J］.中草藥，2011，42（6）：1083－1086.

［6］鄭黎花，郝小江，苑春茂，等.羊耳菊化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2011，24（3）：672－678.

［7］姚 波，梁曉原.羊耳菊揮發(fā)油成分的研究［J］.云南中醫(yī)學院學報，2008，31（6）：27－29.

［8］劉衛(wèi)今，葛 婷，劉勝貴，等.羊耳菊黃酮類化合物的提取與抑菌作用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2010，49（2）：426－429.

［9］莫佳佳，徐慕碟，楊丹丹，等.侗族羊耳菊醇提物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（21）：258－260.

［10］姚 波，楊樹德，梁曉原.羊耳菊的生藥學研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31（9）：39－41.

［11］張治蓉，黃 勇，鄭 林，等.連菊感冒膠囊的質量控制及穩(wěn)定性考察［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2013，33 （8）：603－607.

［12］蘭燕宇，鄭 林，黃 勇，等.甘菊滴丸的質量控制及穩(wěn)定性考察［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（1）：99－102.

［13］陳祖云，遲明艷，王永林.菊黃上清含片的薄層色譜鑒別［J］.中國藥業(yè)，2010，19（16）：23－24.

［14］李洪兵.中藥材的引種與馴化［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2012，5（29）：29－30.

［15］李云隆，彭 銳，李紅莉，等.中藥材種子種苗的發(fā)展策略［J］.中國中藥雜志，2010，35（2）：247－252.

［16］沈宇峰，王志安，余旭平，等.白術種子生活力測定方法及其與發(fā)芽率的相關性研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（3）：248－250.

［17］國際種子檢驗協(xié)會，農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)作物種子質量監(jiān)督檢測中心，浙江大學種子科學中心.1996國際種子檢驗規(guī)程［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社出版，1999.

［18］何伶俐，易 休，陳科力，等.四唑染色法測定白花前胡種子生活力方法研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50 （18）：3775－3777.

［19］凌 敏，楊秀蓮，王良桂.四唑染色法測定巨紫荊種子生活力［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（1）：295－297.

［20］劉若楠，楊志玲，于華會，等.梔子種子生活力測定及其與發(fā)芽率的相關性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（27）：14922－14923.

［21］李衛(wèi)東，王凇翰，于福來，等.益母草種子發(fā)芽和生活力檢驗方法的研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2010，12（11）：15－16.

［22］盛小莉，王凱平.正交設計優(yōu)化當歸多糖提取工藝［J］.中成藥，2008，30（12）：1862－1865.

［23］王艷艷，王團結，丁琳琳.響應面分析法優(yōu)化當歸多糖提取工藝［J］.食品科學，2012，33（10）：146－149.

［24］紀 鵬，張 蔓，孫紅國，等.響應面分析法優(yōu)化當歸多糖提取工藝［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25 （6）：976－981.

［25］李紹林，張建軍.丹參提取工藝優(yōu)選［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（12）：45－47.

［26］黃元紅，衛(wèi)天喜，張發(fā)生，等.星點設計－效應面法優(yōu)選丹參提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16 （17）：28－31.

［27］劉艷杰，項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2007，24（6）：455－457.

（責任編輯：聶克艷）

Optimal Determination Method of Seed Viability of Inula cappa

CHENG Xiaolu，WEI Yibing，WEI Shenghua＊，TAN Longyan

（College of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

In order to find out the best determination conditions of seed viability of I.cappa，the method of 2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride（TTC）was employed with indicators of TTC concentration，dyeing temperature and dyeing time，and the determination conditions were optimized by using orthogonal method and response surface methodology.Results：1.5%，40℃，3hwere the best dyeing conditions of TTC concentration，dyeing temperature and dyeing time respectively.And the order of the three factors influencing seed viability test is dyeing temperature＞dyeing time＞TTC concentration.

Inula cappa；seed；viability；2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride dyeing method

S567

A

1001－3601（2016）08－0350－0100－05

2015－12－30；2016－08－08修回

國家中醫(yī)藥管理局項目“國家基本藥物目錄原料種子種苗繁育（貴州）基地建設”（2014－2015）；貴陽中醫(yī)學院博士基金項目“羊耳菊野生變家種技術研究”（2015）

成小璐（1991－），女，在讀碩士，研究方向：中藥與民族藥品質量及鑒定。E－mail：930368512＠qq.com

＊通訊作者：魏升華（1965－），男，副教授，從事藥用植物資源、引種馴化、中藥材生產(chǎn)與民族醫(yī)藥開發(fā)等的教學和研究。E－mail：weishenghua6512＠126.com