家蠶微粒體GST的鑒定與序列分析

房守敏

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充　637002)

家蠶微粒體GST的鑒定與序列分析

房守敏*

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充637002)

摘要微粒體GSTs(microsomal glutathione S-transferases，mGSTs)是廣泛分布于動(dòng)物、植物、細(xì)菌等生物體中的多功能酶類(lèi)，具有對(duì)藥物解毒和抗氧化等功能。作為一類(lèi)膜蛋白，在研究手段上難于胞質(zhì)型GSTs(cytosolic GSTs)，迄今為止在昆蟲(chóng)中較少展開(kāi)功能研究。本研究在基因組水平對(duì)家蠶mGSTs進(jìn)行了分析，共鑒定出BmmGST1和BmmGST2兩個(gè)基因，它們位于家蠶15號(hào)染色體，呈串聯(lián)排列，無(wú)內(nèi)含子插入。BmmGST1和BmmGST2編碼的蛋白分別含有151和150個(gè)氨基酸殘基，分子量為16.9 kD和16.7 kD。進(jìn)化分析表明，家蠶mGSTs可能是由于世系特異擴(kuò)增而產(chǎn)生的兩個(gè)拷貝。分析表達(dá)序列標(biāo)簽證實(shí)BmmGST1在5齡3 d幼蟲(chóng)的翅原基、絲腺和卵巢組織表達(dá)?；诮M織和發(fā)育時(shí)期芯片，BmmGST2在各組織和發(fā)育期均有表達(dá)信號(hào)。家蠶與其他昆蟲(chóng)、大鼠的mGSTs序列高度保守，是否也有類(lèi)似于哺乳動(dòng)物中的功能值得進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞家蠶；微粒體GST；表達(dá)模式；序列分析

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GSTs)是一個(gè)多功能的超基因家族，廣泛分布于各類(lèi)生物體[1]。根據(jù)其細(xì)胞定位，GSTs可分為胞質(zhì)(cytosolic GSTs)、微粒體(microsomal GSTs，mGSTs)和線(xiàn)粒體(mitochondrial GSTs)三種類(lèi)型，它們均起源于同一祖先序列[2]。胞質(zhì)型GST的基因數(shù)目相對(duì)較多，分布于動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌及真菌[2]。昆蟲(chóng)胞質(zhì)型GST研究主要集中于與有機(jī)磷(organophosphorus，OPs)、有機(jī)氯(organochlorine)和擬除蟲(chóng)菊酯(pyrethroid)等殺蟲(chóng)劑抗性研究[3-6]。線(xiàn)粒體GSTs也叫Kappa GSTs，主要分布于哺乳動(dòng)物的線(xiàn)粒體和過(guò)氧化酶體中，在植物和昆蟲(chóng)中并無(wú)此類(lèi)GSTs的存在。微粒體GSTs是一類(lèi)膜蛋白，現(xiàn)在已被歸類(lèi)為參與花生四烯酸和GSH代謝的膜相關(guān)蛋白(Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism，MAPEG)超家族[7]。盡管微粒體GST與胞質(zhì)和線(xiàn)粒體GST具有共同的祖先，但在序列和結(jié)構(gòu)上已發(fā)生了較大的分化，如：微粒體GST的亞基一級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)較小，大致由150個(gè)氨基酸組成；由同源三聚體構(gòu)成一個(gè)功能單位[8]，線(xiàn)粒體和胞質(zhì)GSTs基本則為同源或異源的二聚體，僅有植物的Lambda GSTs為單聚體[9]。

氧化應(yīng)激是需氧生物體中普遍存在的自然現(xiàn)象。如殺蟲(chóng)劑等有害物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)，能打破體內(nèi)氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡，大量產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)對(duì)膜脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)及糖類(lèi)等生物大分子造成氧化損傷，進(jìn)而產(chǎn)生新的細(xì)胞毒素和誘變劑引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[10-13]。在該鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量顯得尤為重要。氧化應(yīng)激反應(yīng)中還會(huì)伴隨其他有害的醛類(lèi)物質(zhì)，如丙二醛(malondialdehyde, MDA)和4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)。盡管低含量的HNE在細(xì)胞中具有信號(hào)分子的作用，然而高濃度的HNE則對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[14]。在人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物中的研究證實(shí)，微粒體mGST具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中的脂質(zhì)過(guò)氧化氫和醛類(lèi)等有害物質(zhì)進(jìn)行解毒[15]，從而降低殺蟲(chóng)劑等對(duì)生物體引起的氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)，mGST在藥物經(jīng)肝微粒體解毒代謝、抗癌藥物耐藥性中的作用等亦在哺乳動(dòng)物中有廣泛研究[16]。

微粒體mGST作為一類(lèi)膜蛋白，相對(duì)于可溶性的胞質(zhì)型而言，在昆蟲(chóng)中的功能研究相對(duì)滯后。Shi等[17]對(duì)赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)和其他幾種模式昆蟲(chóng)的GST基因進(jìn)行了鑒定和比較分析，同時(shí)對(duì)微粒體mGST進(jìn)行了預(yù)測(cè)。本研究基于上述研究基礎(chǔ)之上，對(duì)家蠶的微粒體mGST進(jìn)行了全基因組鑒定、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式和進(jìn)化分析。旨在為后續(xù)研究家蠶mGST的功能等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1軟件

NCBI下載的BLAST(Basic local alignment search tool)用于同源比對(duì)搜索。ESTs序列的拼接使用DNASTAR中的SeqMan軟件。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA6.0[18]。蛋白分子量MW/等電點(diǎn)pI的預(yù)測(cè)使用在線(xiàn)工具h(yuǎn)ttp://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html。

1.2mGST的鑒定

以Shi等[17]鑒定的其他昆蟲(chóng)mGST氨基酸序列作為query，與家蠶基因組進(jìn)行tblastn搜索。截取與已知mGST同源的家蠶scaffold區(qū)段，用在線(xiàn)工具FGENESH(http://linux1.softberry.com/)預(yù)測(cè)家蠶潛在的mGST編碼區(qū)序列(Coding sequence，CDS)和推導(dǎo)的氨基酸序列。將預(yù)測(cè)得到的家蠶mGST與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant protein database，nr)比對(duì)，驗(yàn)證是否為真實(shí)的mGST。

家蠶mGST編碼區(qū)序列與表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，ESTs)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastn比對(duì)，獲得其對(duì)應(yīng)的ESTs，并利用DNASTAR中的SeqMan軟件對(duì)ESTs序列電子延伸，獲得家蠶mGST 較完整的cDNA序列。延長(zhǎng)后的cDNA序列與家蠶基因組Blastn比對(duì)，分析mGST是否存在內(nèi)含子及插入位置。

2結(jié)果與討論

2.1家蠶mGST的鑒定

以果蠅等昆蟲(chóng)微粒體mGSTs(表1)氨基酸序列與家蠶基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)存在候選mGST的家蠶Scaffold區(qū)段進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)得到的mGST與NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)同源搜索，鑒定是否與已知的其他昆蟲(chóng)mGST同源，最終鑒定出BmmGST1和BmmGST2基因。我們將BmmGST1和BmmGST2的CDS序列與家蠶基因組預(yù)測(cè)的所有蛋白編碼基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.silkdb.org/silkdb/)比對(duì)分析，兩基因均對(duì)應(yīng)于編號(hào)為BGIBMGA007779的預(yù)測(cè)基因(表1)，推測(cè)是由于家蠶基因組基因預(yù)測(cè)錯(cuò)誤所致。

BmmGST1和BmmGST2呈串聯(lián)排列的方式分布于家蠶15號(hào)染色體上。家蠶mGST的CDS與EST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定出對(duì)應(yīng)的ESTs序列，經(jīng)拼接獲得cDNA長(zhǎng)度分別為537bp和571bp。cDNA序列與家蠶基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，均無(wú)內(nèi)含子插入，基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖1。BmmGST1和BmmGST2編碼的蛋白分別含有151和150個(gè)氨基酸殘基，分子量為16.9kD和16.7kD，等電點(diǎn)pI為9.99和9.73。

表1　家蠶與其他模式昆蟲(chóng)mGST基因信息

家蠶mGST為本研究鑒定，其他昆蟲(chóng)mGST基因的信息引自Shi等[17]。a為SilkDB(http://www.silkdb.org/silkdb/)檢索號(hào)；b為Acyrthosiphonpisum基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.aphidbase.com/aphidbase/)；c為FlyBase(http://flybase.org/)；d為VectorBase (http://www.vectorbase.org/)；e為BeeBase(http://hymenopteragenome.org/beebase/)；f為NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；g為T(mén).castaneum基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://beetlebase.org/cgi-bin/gbrowse/BeetleBase3.gff3/)。

灰色框表示非編碼區(qū)，黑色框表示外顯子，箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向和起始密碼子位置。

2.2mGST的進(jìn)化與序列保守性分析

以家蠶微粒體GSTs的蛋白序列與其他模式昆蟲(chóng)mGSTs構(gòu)建鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖2)，結(jié)果表明同一物種的mGST往往聚在一起，暗示在物種分化形成后，mGST發(fā)生了少量的世系特異擴(kuò)增，家蠶由最初的1個(gè)基因擴(kuò)增為2個(gè)mGST。有趣地是，赤擬谷盜的mGST基因數(shù)目最多，含有5個(gè)基因，盡管我們并不清楚mGST為什么會(huì)大量擴(kuò)增，這些擴(kuò)增是否跟倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)的抵御氧化應(yīng)激壓力相關(guān)還值得進(jìn)一步研究。

基于MEGA 6.0 構(gòu)建的鄰近(Neighbor-Joining，NJ)樹(shù)，

方框表示昆蟲(chóng)微粒體mGSTs特異的特征基序，下劃?rùn)M線(xiàn)為跨膜域(transmembrane regions，TM)，

昆蟲(chóng)微粒體mGST編碼的蛋白長(zhǎng)度非常相似，為150個(gè)氨基酸左右(表1)。家蠶與其他昆蟲(chóng)微粒體GSTs的多序列比對(duì)分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)微粒體mGSTs 含有高度保守的V-E-R-V-R-R-A-H-x-N-D-x-E-N-I結(jié)構(gòu)域，這與以前的研究結(jié)果相一致[19]。另外，微粒體mGST作為一種膜蛋白，它們均含有4個(gè)跨膜域，貫穿于整條序列中(圖3)。家蠶BmmGST1和BmmGST2基因編碼蛋白的氨基酸一致性65.3%。BmmGST1和BmmGST2與雙翅目昆蟲(chóng)微粒體GSTs的氨基酸序列一致性分別為42.4%-50.0%和44.2%-49.3%，與蜜蜂AmGSTmic-GB12371的一致性分別為43.9%和40.8%。因此，昆蟲(chóng)微粒體mGSTs在結(jié)構(gòu)和一級(jí)序列上均高度保守。

2.3家蠶mGST的表達(dá)模式

為分析家蠶mGSTs的表達(dá)模式，我們將家蠶mGSTs的CDS序列與家蠶芯片探針數(shù)據(jù)庫(kù)[20]進(jìn)行Blastn比對(duì)檢索，僅BmmGST2有對(duì)應(yīng)的探針sw13395。因此，我們對(duì)BmmGST2在組織和發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)進(jìn)行了分析(圖4)。結(jié)果表明BmmGST2為一個(gè)組成型表達(dá)的基因，在各組織和發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)信號(hào)，并在雌雄個(gè)體中具有相似的表達(dá)模式。但仍有少量的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)雌雄個(gè)體間呈現(xiàn)表達(dá)差異(t-test，P<0.05)，如在雄蛾的表達(dá)信號(hào)值為6905.0±722.7，雌蛾為1 272.6±703.6；5齡3d幼蟲(chóng)精巢的信號(hào)值為2 298.7±988.6，而在卵巢的信號(hào)值為5 236.8±870.0。這些表達(dá)差異是否與BmmGST2在卵的形成和成熟過(guò)程中，防止氧化應(yīng)激帶來(lái)?yè)p傷有關(guān)值得進(jìn)一步研究。

芯片數(shù)據(jù)下載自SilkDB。A)發(fā)育時(shí)期芯片數(shù)據(jù)；B)5齡3d幼蟲(chóng)各組織中的表達(dá)。

通過(guò)與家蠶ESTs數(shù)據(jù)比對(duì)搜索，BmmGST1鑒定出4條ESTs序列，其GenBank的檢索號(hào)為AV405705.1、CK485397.1、BB987310.1和BP179853.1。這些EST分別來(lái)源于5齡3d幼蟲(chóng)的翅原基、絲腺和卵巢組織[21]。因此，BmmGST1在家蠶中仍具有表達(dá)信號(hào)，是一個(gè)具有功能的基因。

經(jīng)生物信息學(xué)分析，家蠶基因組中存在2個(gè)具有功能性的微粒體BmmGST1和BmmGST2基因，其編碼的蛋白分別含有151和150氨基酸。它們?cè)诨蚪M中呈串聯(lián)排列，位于15號(hào)染色體上。家蠶微粒體GST與其他昆蟲(chóng)mGSTs保守性高，即使與大鼠的mGST1也具有保守的結(jié)構(gòu)域(圖3)。在人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的研究表明微粒體GST與藥物代謝、抗氧化等功能相關(guān)[16]，這些高度保守的基因是否在昆蟲(chóng)中也具有相似的功能值得進(jìn)步研究。

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Microsomal GSTs (mGSTs) are a family of multifunctional enzymes found in animals, plants and bacteria, which contain the activity of detoxification and glutathione peroxidase. As one of the membrane proteins, it is difficult to study compared with cytosolic GSTs in insects. In present study, we analyzed putative mGSTs in the silkworm genome, and identifiedBmmGST1 andBmmGST2. They were tandemly located on chromosome 15 and encoded 151 and 150 amino acids, respectively. Molecular weights of them are 16.9 kD and 16.7 kD. Phylogenetic analysis suggested that twoBmmGSTswere the two copies from linage-specific duplication. The putative coding sequence of silkworm mGSTs was used to do Blastn search in the silkworm expressed sequence tags (ESTs) database.BmmGST1 expressed in the wing disc, silkgland and ovary on day 3 of fifth instar larvae. Based on the microarray datasets,BmmGST2 was found to express in all tissues on day 3 of fifth instar larvae and all the developmental stages. Silkworm mGSTs were highly conserved with the other insect andRattusnorvegicusmicrosomal GSTs. It is worth to study whether the silkworm mGSTs contain the similar functions in mammals.

Key wordsBombyxmori; Microsomal GSTs; Expression pattern; Sequence analysis

Identification and sequence analysis of the microsomal GSTs in the silkworm

FANG Shou-min

(CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong637002)

ABSTRACT

資助項(xiàng)目：四川省教育廳自然科學(xué)一般項(xiàng)目(14ZB0139)。