李慧 王雪蕊 楊靜雯 杜斯琪 朱雯 姬彩碩 劉存志

摘要：目的 觀察針刺對血管性癡呆（VD）大鼠海馬突觸傳遞相關(guān)信號分子蛋白激酶C（PKC）、鈣調(diào)蛋白激酶（CaMKⅡ）、N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基（NR2B）的影響，探討針刺治療VD的分子機制。方法 采用栓子注入方法制作多發(fā)性腦梗死癡呆模型，實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、針刺組和非穴組。針刺組針刺“足三里”治療，非穴組于肋下髂嵴上10 mm（非穴）處針刺治療，正常組和模型組大鼠施以與針刺組和非穴組相同強度的捉抓刺激。治療結(jié)束后，ELISA檢測PKC活性，Western blot檢測CaMKⅡ蛋白表達；免疫組化檢測CA1、CA3及DG區(qū)NR2B蛋白表達。結(jié)果 VD大鼠海馬PKC活性、NR2B蛋白表達較正常組顯著下降（P<0.01）；針刺治療后，PKC活性明顯上升（P<0.05），NR2B蛋白表達水平有上升的趨勢。各組CaMKⅡ蛋白表達無明顯變化。結(jié)論 針刺增強海馬神經(jīng)元突觸傳遞信號分子PKC活性，這可能是其治療VD的重要分子靶點之一。

關(guān)鍵詞：針刺；血管性癡呆；海馬；組織蛋白激酶C；鈣蛋白激酶；N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.020

中圖分類號：R245 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0077-05

Effects of Acupuncture on Hippocampal Synaptic Transmission Signal Molecules in Rats with Vascular Dementia LI Hui1， WANG Xue-rui2， YANG Jing-wen2， DU Si-qi2， ZHU Wen2， JI Cai-shuo2， LIU Cun-zhi2 （1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China； 2. Acupuncture and Moxibustion Department， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China）

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on synaptic transmission signal molecules in rats with vascular dementia （VD）， such as PKC， CaMKⅡ and NR2B， and discuss the molecular mechanism of acupuncture treatment for VD. Methods The multi-infarct dementia model was established by injection of emboli into the internal carotid artery. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group， acupuncture group and non-acupoint group. For acupuncture group， acupuncture needles were penetrated into bilateral Zusanli. Non-acupoint group was given acupuncture treatment at the bilateral hypochondrium （10 mm above iliac crest）. The rats in normal group and model group were performed to the same amount of capture stimulation as the acupuncture and non-acupoint groups. After treatment， the hippocampal PKC activity was detected by ELISA. Western blot was used to detect CaMKⅡ expression， and the protein expression of NR2B in CA1， CA3 and DG zones was assayed by immunohistochemical staining. Results Compared with normal group， PKC activity and NR2B expression in the hippocampus significantly decreased in the model group （P<0.01）. After the acupuncture treatment， PKC activity increased significantly （P<0.05）， and the protein expression of NR2B showed a trend to increase. There was no obvious difference in CaMKⅡ expression among all groups. Conclusion Acupuncture at Zusanli can enhance the activity of hippocampal PKC， a synaptic transmission signal molecule， which maybe one of the important molecular targets for the treatment of VD.

Key words： acupuncture； vascular dementia； hippocampus； PKC； CAMKⅡ； NR2B； rats

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2014CB543203）；北京市科技新星計劃（2014B063）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由于腦血管病導(dǎo)致腦組織損害引起的以認知障礙為主要臨床表現(xiàn)的癡呆綜合征。近年來隨著人口的老齡化，VD發(fā)病漸有上升趨勢。VD是僅次于阿爾茨海默病的第2位常見癡呆病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，2012年患癡呆的人數(shù)達0.356億，2050年預(yù)計翻3倍[1]。2010年美國用于癡呆的花費超過了癌癥和心臟疾病[2]，是家庭和社會的沉重負擔(dān)。既往研究表明，針刺能改善中風(fēng)患者和多發(fā)性腦梗死大鼠的認知功能[3-4]。長時程增強效應(yīng)（LTP）是突觸傳遞效能的主要表現(xiàn)形式，反映突觸水平的信息存儲過程，是學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)[5]。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），鈣調(diào)蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）和N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基（N-melthyl-D-asparticacid receptor 2B subunit，NR2B）是重要突觸傳遞相關(guān)信號分子，在學(xué)習(xí)記憶的形成和LTP的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。本研究采用栓子注入模型，觀察針刺治療對突觸傳遞相關(guān)信號分子的影響，探討針刺改善認知損害的分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物

10周齡SPF級雄性Wistar大鼠56只，體質(zhì)量280～300 g，北京維通利華技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所SPF級動物實驗室。

1.2 主要試劑及儀器

水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），PKC活性試劑盒（瑞士Enzo life sciences公司），CaMKⅡ抗體（美國Upstate Biotechnology公司），GAPDH（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），二抗（美國Cell Signaling Technology公司），兔抗鼠NR2B一抗（美國Millipore），二步法抗兔/鼠通用型二抗試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆ｋ娪緝x（北京六一儀器廠），凝膠成像儀Tanon EPS300（上海天能科技有限公司），冰凍切片機（德國Leica 公司），BX51型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus），DHG-9023A烤箱（上海林頻儀器股份有限公司），離心機（美國Beckma）。

2 實驗方法

2.1 分組

56只大鼠隨機分為正常組、模型組、針刺組和非穴組，每組14只。

2.2 造模

采用栓子注入方法復(fù)制多發(fā)性腦梗死癡呆模型[6]。取同種大鼠頸總動脈采血，無菌條件下于37 ℃恒溫箱內(nèi)自然干燥36 h，用100、80目篩子過篩，制備直徑100～200 μm的血凝塊備用。應(yīng)用時每10 mg血凝塊加0.3 mL生理鹽水制成栓子懸濁液。大鼠麻醉后頸正中切開皮膚，暴露頸總動脈、頸外動脈與頸內(nèi)動脈，用兒科0.45 mm頭皮針針頭逆行穿刺右頸外動脈至右頸內(nèi)動脈起始處，隨即用1 mL注射器緩慢注入栓子懸濁液0.3 mL，造成多灶性腦梗死，然后結(jié)扎頸外動脈，縫合皮膚。切口涂抹慶大霉素預(yù)防感染。

2.3 干預(yù)

造模后第3日進行干預(yù)，針刺組取穴參照文獻[7]。取雙側(cè)“足三里”，行捻轉(zhuǎn)補法各30 s。非穴組大鼠選取其雙側(cè)肋下一個固定非穴點（肋下髂嵴上10 mm）作為對照刺激點，行平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法各30 s。每日1次，治療6 d，休息1 d，2周共治療12次。正常組和模型組行與針刺組和非穴組相同時間、相同程度的捉抓刺激。

2.4 指標(biāo)檢測

治療結(jié)束后第2日，各組大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛（35 mg/100 g體質(zhì)量）麻醉。一部分大鼠麻醉后斷頭快速取出腦組織，分離出海馬，-80 ℃冰箱保存，用于PKC活性和CaMKⅡ蛋白表達的測定。另一部分大鼠麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，然后斷頭取出腦組織，35%蔗糖脫水后切片，用于NR2B蛋白表達的測定。

2.4.1 蛋白激酶C活性測定 每1 g海馬加5 mL裂解液，冰浴條件下手動勻漿使其溶解，用微型離心機4 ℃、15 000×g離心30 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。BCA法進行蛋白定量后， ELISA檢測。加50 μL激酶緩沖液/孔，室溫10 min，吸出。上樣30 μL，空白孔加入激酶緩沖液，陽性對照加入PKC溶液。加10 μL ATP/孔，30 ℃、孵育90 min。停止反應(yīng)后再吸出，加40 μL磷酸化特異性抗體/孔，室溫孵育60 min，洗孔后，加40 μL抗兔抗體/孔，室溫孵育30 min，洗孔后，加60 μL TMB/孔，室溫孵育30～60 min，觀察顏色變化由藍變黃，加20 μL停止液/孔，停止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定吸光度（OD）值。實驗組OD值與正常組OD值的之比表示PKC活性。

2.4.2 鈣調(diào)蛋白激酶蛋白表達測定 Western blot檢測CaMKⅡ蛋白表達。每組蛋白取2 μg上樣于10%SDS-PAGE膠，電泳2 h；用濕轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)完后將膜用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h；加入特異性的一抗，4 ℃孵育過夜；TBST液漂洗4次（5 min/次），加二抗，室溫孵育1 h，TBST液漂洗后，采用Odyssey近紅外雙色激光成像分析軟件處理，記錄每條蛋白電泳帶的平均光密度值，進行定量分析。

2.4.3 NR2B蛋白表達測定 免疫組化染色檢測NR2B的蛋白表達。將切片用PBS沖洗后，置于3%雙氧水溶液中室溫孵育10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶；再將切片用PBS沖洗3次（5 min/次），用正常山羊血清封閉液室溫下封閉0.5 h，將切片置于兔NR2B一抗（1∶200，PBS稀釋），4 ℃過夜。室溫靜置0.5 h，PBS充分沖洗后，將切片置于抗兔二抗稀釋液（1∶200），室溫孵育1 h；用PBS沖洗后，DAB顯色劑（1∶20）顯色2 min，再用蘇木精溶液復(fù)染。置于75%鹽酸乙醇10 s，蒸餾水沖洗10 min后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明封片。