滋腎通關(guān)膠囊質(zhì)量標準研究

劉東順 熊筱娟 吳志軍 樸淑娟 陸文銓

摘要：目的 建立滋腎通關(guān)膠囊的質(zhì)量標準。方法 采用薄層色譜法對制劑中知母、黃柏進行定性鑒別。采用高效液相色譜法同時對制劑中新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿進行定量檢測。結(jié)果 通過薄層鑒別分別檢出知母中的芒果苷、黃柏中的鹽酸黃柏堿。新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿分別在0.025 25～2.02 ?g（r=0.999 7）、0.025 5～2.04 ?g（r=0.999 7）、0.026～2.08 ?g（r=0.999 7）、0.025 5～2.04 ?g（r=0.999 6）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.99%、101.06%、103.05%、100.55%，RSD分別為2.69%、5.62%、2.49%、2.06%。結(jié)論 本方法準確、快速、穩(wěn)定、可靠，重復性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制及評價。

關(guān)鍵詞：滋腎通關(guān)膠囊；質(zhì)量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法；新芒果苷；鹽酸黃柏堿；芒果苷；鹽酸小檗堿

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.027

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0104-04

Study on Quality Standard for Zishen Tongguan Capsules LIU Dong-shun1，2， XIONG Xiao-juan2， WU Zhi-jun1， PIAO Shu-juan1， LU Wen-quan1 （1. Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003， China； 2. College of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Yichun 336000， China）

Abstract： Objective To establish a quality standard for Zishen Tongguan Capsules. Methods Anemarrhneae Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex were qualitatively identified by TLC method. The contents of neomangferin， phellodendrine hydrochloride， mangiferin and berberine hydrochloride in Zishen Tongguan Capsules were quantitatively determined by HPLC method. Results The spots of qualitative identification method were clear without interference. Neomangferin in Anemarrhneae Rhizoma and phellodendrinehy drochloride in Phellodendri Chinensis Cortex were identified. Neomangferin， phellodendrinehy drochloride， mangiferin and berberine hydrochloride showed good linearity in the range of 0.025 25–2.02 ?g （r=0.999 7）， 0.025 5–2.04 ?g （r=0.999 7）， 0.026–2.08 ?g （r=0.999 7）， and 0.025 5–2.04 ?g （r=0.999 6） respectively. The average recoveries of neomangferin， phellodendrinehy drochloride， mangiferin and berberine hydrochloride were 99.99%， 101.06%， 103.05%， and 100.55%， respectively. The RSD were 2.69%， 5.62%， 2.49%， and 2.06%， respectively. Conclusion The method is accurate and rapid， with good stability， reliability and reproducibility， which can be used for the quality control and evaluation of the preparation of Zishen Tongguan Capsules.

Key words： Zishen Tongguan Capsules； quality standard； TLC； HPLC； neomangferin； phellodendrinehy drochloride； mangiferin； berberine hydrochloride

滋腎通關(guān)膠囊由知母、黃柏、肉桂等中藥提取加工而成，處方出自李東垣《蘭室秘藏》，適于“不渴而小便閉，熱在下焦血分也”，具有滋腎清熱、化氣通關(guān)之功，用于治療熱蘊膀胱之小腹脹滿、尿閉不通?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)該方在治療前列腺增生、預防尿路感染、治療肝硬化腹水等方面也有一定療效[1-3]。芒果

基金項目：軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高計劃（14ZJZ04-1）

通訊作者：陸文銓，E-mail：lwqp@163.com

苷和新芒果苷為知母清熱作用的主要有效成分，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、利尿、預防肥胖、免疫抑制等作用[4-7]；黃柏中的鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿既是其活性成分又是指標成分[8]。為更好控制該制劑質(zhì)量，本研究采用TLC對方中知母、黃柏進行定性鑒別，采用HPLC對方中新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿進行定量檢測。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent，美國），包括G1311C輸液泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G4212B-DAD紫外檢測器、Chemstation色譜工作站；十萬分之一天平（Sartorius CPA225D，德國）；旋渦振蕩混和器WL-901 Vortex（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；超聲儀（SK7200H型，上?？茖С晝x器有限公司）。

滋腎通關(guān)膠囊（批號140429、140430、140431），解放軍第二軍醫(yī)大學上海長征醫(yī)院制劑中心研制；芒果苷對照品（批號MB6776），大連美侖生物技術(shù)有限公司；新芒果苷對照品（批號15011309），上海士峰生物科技有限公司；鹽酸黃柏堿對照品（批號111895-201303）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212），中國食品藥品檢定研究院；知母對照藥材（批號130801）、黃柏對照藥材（批號130901），安徽亳州利鋒藥業(yè)有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 知母

取3批研細后的本品內(nèi)容物各1 g，各加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液濃縮至干，殘渣用90%甲醇5 mL溶解，作為供試品溶液。另取知母對照藥材1 g，加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至干，殘渣用90%甲醇5 mL溶解，作為對照藥材溶液。另取缺知母的陰性樣品，同法制得陰性對照溶液。另取芒果苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B][9]試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各4 ?L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲酸（1∶7∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視[10-11]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品在相應位置上無干擾。

2.2 黃柏

取3批研細后的本品內(nèi)容物各1 g，各加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液濃縮至干，殘渣用90%甲醇5 mL溶解，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材1 g，加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液濃縮至干，殘渣用90%甲醇5 mL溶解，作為對照藥材溶液。另取缺黃柏的陰性樣品，同法制得陰性對照溶液。另取鹽酸黃柏堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B][9]試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各4 ?L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-水-甲酸（4∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液[12-13]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品在相應位置上無干擾。

3 芒果苷含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m，柱號201054653）；流動相：乙腈?0.1%磷酸（1000 mL加50 ?L二乙胺），梯度洗脫（0～10 min，2%～11%乙腈；10～21 min，11%乙腈；21～22 min，11%～9%乙腈；22～30 min，9%乙腈；30～34 min，9%～24%乙腈；34～50 min，24%乙腈；50～60 min，24%～60%乙腈），2次進樣之間用初始流動相平衡10 min；檢測波長：265 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 ?L。

3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取新芒果苷對照品2.02 mg、鹽酸黃柏堿對照品2.04 mg、芒果苷對照品2.08 mg、鹽酸小檗堿對照品2.04 mg，分別置于1 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min使溶解，放至室溫，定容，制得對照品溶液。精密量取各對照品溶液適量，加初始流動相混勻定量稀釋成每1 mL含新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿分別為404、408、416、408 ?g的混合對照品貯備液，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

3.3 供試品溶液的制備

取滋腎通關(guān)膠囊內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率200 W，頻率53 Hz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用90%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對照品的制備

取除知母、黃柏外的其他藥材，按“3.3”項下方法制備，即得。

3.5 空白試驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按上述方法進樣，結(jié)果陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

3.6 線性關(guān)系考察

將混合對照品儲備液用初始流動相逐級稀釋成相當于1/2、1/8、1/10、1/20、1/80、1/160濃度混合對照品貯備液的系列溶液，分別吸取10 ?L注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，以峰面積對濃度（?g/mL）進行線性回歸計算，得線性回歸方程。各對照品濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

3.7 精密度試驗

取混合對照品溶液，進樣10 ?L，重復進樣6次，在上述色譜條件下測定，記錄峰面積，結(jié)果新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.55%、0.55%、0.43%、0.45%，表明儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號140429），分別于0、2、4、8、12、24 h分別樣測定峰面積，結(jié)果新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為3.83%、2.45%、2.65%、2.34%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 重復性試驗

取同一批滋腎通關(guān)膠囊（批號140429），精密稱取6份，按“3.3”項下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.43%、1.11%、0.78%、0.62%，表明該方法重復性良好。

3.10 加樣回收率試驗

分別精密稱取6份已測定含量的樣品，置于具塞錐形瓶中，精密加入一定量的混合對照品，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 ?L，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

3.11 樣品含量測定

取樣品3批，按“3.3”項下方法每批制備3份供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，分別代入回歸方程，計算樣品中各成分含量，結(jié)果見表3。

4 討論

中藥成方制劑通常由多味藥組成，其藥效是多種活性物質(zhì)綜合發(fā)揮作用的結(jié)果，若只對單味藥或單一成分進行檢測，難以全面控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗采用TLC對處方中的知母、黃柏進行定性鑒別，采用HPLC同時測定滋腎通關(guān)膠囊中新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法簡便可行，能夠有效控制該制劑的質(zhì)量。

試驗比較了超聲提取和回流提取2種方法制備供試品溶液，所測各成分含量無明顯差異，因超聲法具有操作簡便、提取效率高等優(yōu)點，故選用超聲提取法；篩選提取溶劑時考察了甲醇、90%甲醇、75%甲醇，結(jié)果90%甲醇提取效果較好；考察了超聲提取30、40、50 min的提取效果，結(jié)果相當[14]。故確定90%甲醇為提取溶劑，超聲提取時間為30 min。

通過DAD檢測器對供試品色譜200～400 nm進行光譜掃描，結(jié)果顯示新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿最大吸收波長分別為258、284、258、265 nm。由于滋腎通關(guān)膠囊中新芒果苷、鹽酸黃柏堿含量較低，為了兼顧新芒果苷、鹽酸黃柏堿的檢測準確度，故選擇265 nm為檢測波長，在此波長處4個成分均可得到滿意的靈敏度。

流動相考察中，選擇了乙腈-乙酸[15-16]、乙腈-磷酸鹽[17]、甲醇-磷酸[18]系統(tǒng)進行比較。結(jié)果表明采用乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)能達到完全分離并且峰形較好，故選擇乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)作為流動相。

參考文獻：

[1] 孫赫.滋腎通關(guān)丸治療前列腺增生的藥理機制研究及其物質(zhì)基礎探索[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2007.

[2] 李華偉.滋腎通關(guān)膠囊對尿路感染的預防作用[J].河南中醫(yī)，2014， 34（5）：971-972.

[3] 周晴，徐燎宇.滋腎通關(guān)丸治療肝硬化腹水42例觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（9）：21-22.

[4] YOOSOOK C， BUNYAPRAPHATSARA N， BOONYAKIAT Y， et al. Anti-herpes simplex virus activities of crude water extracts of Thai medicinal plants[J]. Phytomedicine，2000，6（6）：411-419.

[5] YOSHIKAWA M， SHIMODA H， NISHIDA N， et al. Salacia reticulata and its polyphenolic constituents with lipase inhibitory and lipolytic activities have mild antiobesity effects in rats[J]. J Nutr，2002，132（7）：1819-1824.

[6] MURUGANANDAN S， GUPTA S， KATARIA M， et al. Mangiferin protects the streptozotocin-induced oxidative damage to cardiac and renal tissues in rats[J]. Toxicology，2002，176（3）：165-173.

[7] MAKARE N， BODHANKAR S， RANGARI V. Immunomodulatory activity of alcoholic extract of Mangifera indical in mice[J]. J Ethnopharmacol， 2001，78（2/3）：133-137.

[8] 鄭洪艷，徐為人.小檗堿藥理作用研究進展[J].中草藥，2004，35（6）： 708-711.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：198，286.

[10] 鄧家剛，陳勇，王勤，等.芒果苷原料藥的質(zhì)量標準研究[J].中藥材， 2007，30（11）：1464-1466.

[11] 李文琪，陳明生，溫幼敏，等.光石韋藥材中芒果苷的定性定量分析方法研究[J].廣西科學，2012，19（1）：77-79.

[12] 沈濤，梁海寧，畢映燕.萆清栓質(zhì)量標準研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（10）：71-73.

[13] 程力惠，盧麗霞.復方黃柏液的質(zhì)量標準研究[J].亞熱帶植物科學， 2012，41（2）：13-18.

[14] 鄭東昆，陳偉康，黃波.裸花紫珠膠囊質(zhì)量標準研究[J].中成藥， 2015，37（4）：774-778.

[15] 王金余，孫富增，姚仲青，等.百合知母膠囊的質(zhì)量標準研究[J].武警醫(yī)學，2012，23（7）：601-604.

[16] KULLU J， DUTTA A， CONSTALES D， et al. Experimental and modeling studies on microwave-assisted extraction of mangiferin from Curcuma amada[J]. 3 Biotech，2014，4（2）：107-120.

[17] 張登山，周琴妹.滋腎通關(guān)膠囊標準的建立[J].中國藥師，2010， 13（5）：672-674.

[18] 蔡興東.HPLC法測定川東獐牙菜中芒果苷的含量[J].北方藥學， 2014，11（6）：4-5.

（收稿日期：2015-08-14）

（修回日期：2015-08-23；編輯：陳靜）