朱密

摘 要：該文介紹了豬傳染性胃腸炎病毒基因組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方式，并分析了各功能蛋白的主要功能，最后分別介紹了核酸探針、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、套式PCR、熒光定量RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等分子生物學(xué)檢測方法在豬傳染性胃腸炎病毒檢測中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學(xué)檢測方法

中圖分類號 S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）12- 0110-02

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導(dǎo)致豬出現(xiàn)脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發(fā)病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發(fā)生于美國，隨后在世界各地均有發(fā)生，我國于20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)該病，目前全國大部分地區(qū)均發(fā)生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發(fā)病后死亡率最高，高達(dá)100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會影響仔豬后期的生長，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動物衛(wèi)生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于各種細(xì)菌性和病毒性疾病的檢測[2]。本文綜述了分子生物學(xué)技術(shù)在傳染性胃腸炎中的應(yīng)用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。

1 傳染性胃腸炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方式

1.1 TGEV基因組結(jié)構(gòu) 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節(jié)段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個(gè)區(qū)29kb，結(jié)構(gòu)序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價(jià)鍵結(jié)合的poly結(jié)構(gòu)，5'末端有帽結(jié)構(gòu)[3]?；蚪M1約有20kb，主要負(fù)責(zé)病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結(jié)構(gòu)蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結(jié)構(gòu)蛋白。

1.2 基因表達(dá)方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現(xiàn)了mRNA的功能，使基因1轉(zhuǎn)錄表達(dá)RNA聚合酶，同時(shí)該基因有作為模板合成負(fù)鏈RNA，進(jìn)而親代RNA與負(fù)鏈RNA形成雙鏈復(fù)制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細(xì)胞內(nèi)，可以檢測出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個(gè)特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測指標(biāo)之一[4]。

2 結(jié)構(gòu)蛋白及功能

豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結(jié)構(gòu)，也影響著病毒對細(xì)胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構(gòu)成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區(qū)、信號肽、極性區(qū)、跨膜區(qū)突于病毒粒子內(nèi)C-端區(qū)等功能區(qū)域構(gòu)成，分子質(zhì)量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點(diǎn)和裝配位點(diǎn)，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)，分子量為47KDa，含有382個(gè)氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)對病毒基因組的加工、復(fù)制都具有重要作用。sM蛋白分子質(zhì)量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個(gè)氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細(xì)胞免疫中具有重要作用。

3 分子生物學(xué)檢測方法

3.1 核酸探針 核酸探針檢測方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補(bǔ)，在堿基互補(bǔ)過程中，采用標(biāo)記物標(biāo)記與被檢測靶序列互補(bǔ)的單鏈核酸分子，進(jìn)而檢測到目的核序列。該檢測方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗(yàn)、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實(shí)現(xiàn)快速檢測的目的?，F(xiàn)代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴(kuò)增出與其對應(yīng)的病毒模板，對其他病毒模板影響不大，同時(shí)核酸探針擴(kuò)增的最低檢測限為3 000～6 000個(gè)拷貝的單個(gè)病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。

3.2 普通RT-PCR方法 該檢測方法使用的首要條件是知道被檢測病原的相關(guān)目的基因序列，根據(jù)相關(guān)目的序列后，采用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增目的基因，進(jìn)而達(dá)到檢測的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒檢測具有較好的重復(fù)性和特異性。

3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測方法是以普通PCR為基礎(chǔ)發(fā)展的一種新型檢測方法，該檢測方法可以在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，并通過采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件，達(dá)到同時(shí)檢測多種病原的目的，具有快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前也常用于各種疾病的診斷?；艚鹨萚8]建立了多重RT-PCR法檢測傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對該檢測方法進(jìn)行了敏感性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，多重RT-PCR法可以檢測出50TCID50的混合病毒，且能擴(kuò)增出長度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。

3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對引物，并通過2次擴(kuò)增對樣品進(jìn)行檢測，該方法相對其他PCR檢測方法，具有較高的敏感性，且節(jié)約成本?，F(xiàn)代研究表明，PCR技術(shù)在檢測病毒時(shí)，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測出，表明套式PCR比常規(guī)PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據(jù)兩組病毒的基因序列分別設(shè)計(jì)了2對引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細(xì)胞和豬傳染性胃腸炎病毒細(xì)胞為模板進(jìn)行套式PCR特異性片段擴(kuò)增，結(jié)果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴(kuò)增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴(kuò)增的基因片段為886bp，同時(shí)檢測出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。

3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測方法的原理是在PCR反應(yīng)體系中采用熒光探針標(biāo)記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標(biāo)記PCR的反應(yīng)產(chǎn)物，然后使用反應(yīng)儀器收集反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號，并根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱確定產(chǎn)物的量，進(jìn)而達(dá)到與起始模板準(zhǔn)確定量的目的。該檢測方法與常規(guī)RT-PCR相比，不需要進(jìn)行電泳試驗(yàn)檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)果更為直觀、方便，同時(shí)又避免了因電泳試驗(yàn)對環(huán)境造成污染。王建中等[10]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設(shè)計(jì)了引物，并通過多組試驗(yàn)對熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，優(yōu)化后的檢測方法對其他病原的檢測結(jié)果均為陰性，檢測結(jié)果的敏感性高達(dá)43.07拷貝/μL，是常規(guī)PCR檢測方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近幾年新興的一種分子生物學(xué)檢測方法，因其具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測速度以及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒病和細(xì)菌病檢測。高睿澤等[11]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，并對該檢測方法的敏感性和特異性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴(kuò)增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應(yīng)，具有加高的特異性；同時(shí)該檢測方法可以檢測到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規(guī)PCR高出3個(gè)數(shù)量級。

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（責(zé)編：張宏民）