油茶優(yōu)良無(wú)性系‘閩43’和‘閩60’果實(shí)發(fā)育過(guò)程中油脂積累規(guī)律研究

陳俊杰　湯佳　陳輝　鄭國(guó)華　鄭鈺銦　劉國(guó)敏

摘 要 以油茶優(yōu)良無(wú)性系‘閩43和‘閩60所產(chǎn)果實(shí)為試材，研究油茶果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中油脂積累規(guī)律。結(jié)果表明，‘閩43和‘閩60種子中乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）和磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性均在9月至果實(shí)成熟期間快速上升，基本上與種子內(nèi)油脂合成的高峰期相吻合，ACCase和PPase活性與種子中粗脂肪含量均呈顯著正相關(guān)，表明油茶種子內(nèi)ACCase和PPase活性促進(jìn)了油脂合成。兩無(wú)性系種子的粗脂肪含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)，與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關(guān)?？梢?jiàn)油脂的積累伴隨著蛋白質(zhì)與糖類的代謝、分解與轉(zhuǎn)化，推測(cè)一部分的蛋白質(zhì)和糖類可被代謝轉(zhuǎn)化形成油脂。

關(guān)鍵詞 油茶；果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育；油脂積累；油脂合成相關(guān)酶

中圖分類號(hào) S606.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

油茶（Camellia oleifera Abel.）屬山茶科山茶屬常綠小喬木或灌木，廣義上油茶泛指山茶屬中油脂含量較高并具有一定栽培面積的物種，與油棕、油橄欖、椰子并稱為“世界四大木本食用油料植物”[1-2]。油茶極具利用價(jià)值，其果實(shí)中的茶籽榨取的茶油色清而味香。茶油中亞油酸和亞麻酸的含量比例為4 ∶ 1，是營(yíng)養(yǎng)學(xué)界里最佳配比的“腦黃金”。茶油的脂肪酸結(jié)構(gòu)和比例與橄欖油極其相似，有“東方橄欖油”的美稱[3]。

油脂是木本食用油料植物果實(shí)的主要成分，因此含油量成為評(píng)價(jià)油料植物果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。Mahmood等對(duì)112個(gè)芥菜型油菜DH系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)油脂含量與蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)[4]。目前，對(duì)于油茶果實(shí)的研究大多集中在與果實(shí)含油量相關(guān)的影響因子[5-6]、成熟果實(shí)脂肪酸組成分析[7-9]、果實(shí)病蟲(chóng)害防治[10-12]、油茶果實(shí)表型性狀的變異[13-16]以及采后生理[17-19]等幾個(gè)方面，對(duì)油茶果實(shí)采前生理即生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的系統(tǒng)研究較少。本文以福建省油茶主栽無(wú)性系‘閩43和‘閩60為材料，研究油茶果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中油脂積累的變化規(guī)律，旨在揭示油茶果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育及油脂轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，為栽培實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為福建省2個(gè)普通油茶優(yōu)良無(wú)性系‘閩43和‘閩60所產(chǎn)的果實(shí)，這2個(gè)無(wú)性系種植于福建省閩侯縣桐口國(guó)有林場(chǎng)油茶種質(zhì)資源圃，和其它無(wú)性系一起采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，每個(gè)無(wú)性系10株為一小區(qū)，共3個(gè)區(qū)組。該林場(chǎng)地處E 119°17'、N 26°05'，氣候溫和，雨量充沛，海拔高度約為100 m，適宜油茶生長(zhǎng)。課題組前期已對(duì)這兩個(gè)無(wú)性系的果實(shí)形態(tài)性狀進(jìn)行了測(cè)定[20]。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集方法 2014年4月1日至11月9日，對(duì)各無(wú)性系果實(shí)進(jìn)行觀察和取樣測(cè)定。選取樹(shù)體特征與生長(zhǎng)條件基本一致的無(wú)病蟲(chóng)害植株，在晴朗或陰天的上午10 ： 00左右定期連續(xù)采樣，共采樣12次。7月10日之前每隔30 d采1次，7月10日之后油脂合成逐漸增多，適當(dāng)縮短取樣時(shí)間，每隔15 d采集1次，直至果實(shí)完全成熟。在油茶種質(zhì)資源圃中每個(gè)區(qū)組隨機(jī)采集3個(gè)植株的果實(shí)，每個(gè)植株從東南西北4個(gè)方向采收生長(zhǎng)發(fā)育期接近、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)各10個(gè)。采摘的油茶果實(shí)用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室，立即敲碎分離果皮和種子，待種皮硬化后剝離，將種子用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 粗脂肪及果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 粗脂肪的測(cè)定采用索氏抽提法，參照陳永忠等[21]的方法?？扇苄蕴恰⒄崽堑臏y(cè)定參考張志良等[22]的方法。可溶性蛋白、還原糖的測(cè)定參照王學(xué)奎[23]的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》，其中可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；可溶性淀粉的測(cè)定參照宗學(xué)鳳等[24]的蒽酮比色法。

1.2.3 乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）活性的測(cè)定

參照楊若琳等[25]的方法稍作改進(jìn)。稱3 g鮮樣，切碎于研缽中，加入少量石英砂后再加入5 mL預(yù)冷的提取Buffer快速研磨，轉(zhuǎn)入50 mL離心管，于研缽中再加入5 mL預(yù)冷的提取Buffer將殘余的樣品全部轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4 ℃條件下靜置2 h。將靜置后的勻漿液離心30 min（4 000 r/min，4 ℃），留清液棄沉淀。將上清液繼續(xù)離心30 min（10 000 r/min，4 ℃），棄去沉淀，保留上清液，即為待測(cè)液，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管內(nèi)備用。應(yīng)用植物乙酰輔酶A羧化酶（ACC）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒的說(shuō)明方法對(duì)ACCase的活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性的測(cè)定

參照西北農(nóng)業(yè)大學(xué)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)測(cè)定[26]，酶活性以每小時(shí)每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生的P的毫克數(shù)，單位為mg/（g·h）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理繪圖。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析、多重比較和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗脂肪含量變化

油茶‘閩43與‘閩60果實(shí)粗脂肪含量的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示，果皮和種子中粗脂肪含量變化差異大，果皮中粗脂肪含量整體水平較低?！}43果皮中粗脂肪含量在8月9日前甚微，8月9日后緩慢增多，9月10日達(dá)到最大值2.94%，此后逐漸下降；種子中粗脂肪含量在6月10前含量同樣甚微，幾乎無(wú)測(cè)出，7月10日后開(kāi)始緩慢增加，9月26日后粗脂肪含量開(kāi)始急劇上升，在果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值45.05%?！}60果皮中粗脂肪含量在7月26日前幾乎無(wú)測(cè)出，在8月9日達(dá)到最大值1.90%，此后逐漸下降；種子中粗脂肪含量在9月10日前均處于較低水平，9月10日后幾乎呈線性上升直至果實(shí)成熟，成熟時(shí)果實(shí)粗脂肪含量為43.48%。總體上，可以看出油茶果實(shí)中脂肪的積累主要在種子中，且油茶種子中粗脂肪的積累主要在生長(zhǎng)的中后期，這與大多數(shù)的油料植物種子中脂肪的積累規(guī)律相近。

2.2 乙酰輔酶A羧化酶活性變化

油茶‘閩43與‘閩60果實(shí)內(nèi)ACCase活性的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示，兩無(wú)性系果皮中ACCase活性變化幅度較小，維持在較低水平波動(dòng)?！}43種子中ACCase活性在7月26日前與果皮基本一致，處在較低水平，7月26日之后酶活性開(kāi)始緩慢上升，9月26日后開(kāi)始急劇上升，果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值2 929.19 U/L。而‘閩60種子中ACCase活性在9月10日前與果皮基本一致，處于較低水平波動(dòng)變化，9月10日之后酶活性開(kāi)始呈近似線性快速上升，直至果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值2 157.68 U/L。

2.3 磷脂酸磷酸酯酶活性變化

油茶‘閩43與‘閩60果實(shí)內(nèi)PPase活性的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示，兩無(wú)性系果皮中PPase活性變化幅度較小，維持在較低水平，總體上呈下降趨勢(shì)。‘閩43種子中PPase活性在7月26日前處在較低水平，且呈緩慢下降趨勢(shì)，7月26日之后酶活性開(kāi)始急劇上升，果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值60.30 mg/（g·h）。而‘閩60種子中PPase活性在8月9日前與果皮基本一致，穩(wěn)定在較低水平，8月9日之后酶活性開(kāi)始呈近似線性快速上升，直至果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值83.96 mg/（g·h）。

2.4 油茶果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間脂類合成酶與粗脂肪的相關(guān)性分析

‘閩43和‘閩60果皮和種子中ACCase活性和PPase活性與粗脂肪的相關(guān)性分析如表1所示。由表1可見(jiàn)，兩無(wú)性系果皮中ACCase活性均與粗脂肪含量呈正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)不大；而兩無(wú)性系果皮中PPase活性均與粗脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，其中‘閩43果皮中PPase活性與粗脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.05）。兩無(wú)性系種子中ACCase活性均與粗脂肪含量呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）；PPase活性也均與粗脂肪含量達(dá)到極顯著正相關(guān)（p<0.01）。表明油茶種子中高活性的ACCase和PPase極大促進(jìn)粗脂肪的合成。

2.5 油茶果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間粗脂肪與其它果實(shí)性狀的相關(guān)性分析

為了探討油茶果實(shí)中油脂積累與其它果實(shí)性狀的相關(guān)關(guān)系，在‘閩43和‘閩60果實(shí)粗脂肪含量迅速增加到峰值期間，對(duì)果形、可溶性糖、蔗糖、還原糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化與種子中粗脂肪含量進(jìn)行了相關(guān)分析。由表2可以看出，兩無(wú)性系種子的粗脂肪含量均與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)（p<0.05），與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。其中，‘閩60種子中粗脂肪含量與果形指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01）。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩無(wú)性系均表現(xiàn)為果皮粗脂肪含量遠(yuǎn)低于種子中粗脂肪含量，表明油茶果實(shí)中種子含油量占極大份額。‘閩43果實(shí)比‘閩60更早開(kāi)始油脂的合成，但兩無(wú)性系油脂合成的高峰期均主要集中在9月10日至果實(shí)成熟期間。

油脂的合成起始于ACCase催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，ACCase是催化脂肪合成的限速酶。三酰甘油是通過(guò)二酰甘油轉(zhuǎn)化生成的，而二酰甘油的形成得益于PPase的催化作用[27]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，‘閩43和‘閩60果皮中ACCase和PPase活性均穩(wěn)定于低水平范圍，而種子中ACCase和PPase活性均在9月至果實(shí)成熟期間快速上升，基本上與種子內(nèi)油脂合成的高峰期相吻合，此期間ACCase和PPase活性與種子中粗脂肪含量的正相關(guān)都達(dá)到極顯著水平，表明油茶種子內(nèi)ACCase和PPase是參與油脂合成代謝的調(diào)節(jié)酶，在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其活性的大小可以促使粗脂肪含量發(fā)生變化。同時(shí)，在此期間兩無(wú)性系種子的粗脂肪含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)（p<0.05），與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。油脂的積累伴隨著蛋白質(zhì)與糖類的代謝、分解與轉(zhuǎn)化，推測(cè)一部分的蛋白質(zhì)和糖類在油脂轉(zhuǎn)化過(guò)程中形成油脂，這與張凌云等[28]的研究結(jié)果相吻合。而‘閩60種子中粗脂肪含量與果形指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），表明果形指數(shù)可作為此品種果實(shí)采集的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，在油脂合成高峰期，‘閩43種子內(nèi)ACCase活性水平（1 339.19 ～2 929.19 U/L）顯著大于‘閩60（1 161.66～2 157.68 U/L），這大概也是引起兩油茶無(wú)性系種子粗脂肪含量差異的主要原因之一。油脂的生物合成是由數(shù)十種酶共同參與，除了ACCase和PPase外，還有許多其他酶對(duì)油脂的合成過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，如植物脂肪酸合酶系統(tǒng)（FAS）和植物脂酞ACP脫飽和酶等，本文僅初步探索了油茶果實(shí)中ACCase和PPase活性的變化，而油脂轉(zhuǎn)化和積累過(guò)程中相關(guān)的其他酶及其作用還需進(jìn)一步深入研究。

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