蔡永豪，徐雪姑，林佩珍，郁引飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000)

HPLC法測(cè)定夏天無(wú)滴眼液中原阿片堿的含量

蔡永豪，徐雪姑，林佩珍，郁引飛Δ

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000)

目的 建立測(cè)定夏天無(wú)滴眼液中原阿片堿含量的HPLC法。方法 采用ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)色譜柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液 (25:75)為流動(dòng)相，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果 在該色譜條件下，原阿片堿在濃度14.2～142 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999,n=9),加樣回收率為104.5%，RSD為2.47%，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于1%(n=5)，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可以用于測(cè)定夏天無(wú)滴眼液中原阿片堿的含量。

夏天無(wú)滴眼液；原阿片堿；HPLC；含量測(cè)定

夏天無(wú)滴眼液主要功效為活血明目舒筋。用于血瘀筋脈阻滯所致的青少年遠(yuǎn)視力下降、不能久視；青少年假性近視癥見(jiàn)上述癥候者。成份包含原阿片堿、四氫巴馬汀、球紫堇堿，以及其它少量各種植物堿。其主要成份普魯托品(原阿片堿)能直接松弛平滑肌，解除睫狀肌的緊張，其解痙作用比阿托品弱,但無(wú)阿托品那樣的散瞳及升高眼壓的副作用。中國(guó)藥典采用檢測(cè)原阿片堿的含量進(jìn)行夏天無(wú)滴眼液的質(zhì)量控制，文獻(xiàn)報(bào)道的原阿片堿等生物堿的含量測(cè)定方法有薄層掃描法[1-2]、毛細(xì)管電泳法[3]、HPLC法[4-10]、LC/MS法[11]等。薄層掃描法操作繁瑣,容易產(chǎn)生誤差。毛細(xì)管電泳法分離能力較弱，并且對(duì)pH值要求較高。液質(zhì)聯(lián)用儀器使用成本較高。HPLC法能快速分離并檢測(cè)原阿片堿，且方法靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好。但存在流動(dòng)相配制復(fù)雜，樣品處置過(guò)程復(fù)雜，測(cè)定時(shí)儀器穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)[4-10]。本研究在文獻(xiàn)[4-11]的基礎(chǔ)上，摸索建立了一種更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定夏天無(wú)滴眼液中主要成份原阿片堿含量的高效液相色譜方法，在實(shí)際樣品的含量分析中取得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Aglient1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)；FA1104型電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；滅菌注射用水(四川科倫藥業(yè))；原阿片堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110853-201003，含量：99.9%)；夏天無(wú)滴眼液(江西珍視明藥業(yè)，批號(hào)：141101，150301，150901，規(guī)格：10 mL)；乙腈、三氟乙酸為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性：色譜柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%三氟乙酸(25:75)，流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；進(jìn)樣量：20 μL。主峰的拖尾因子小于2.0，理論板數(shù)按原阿片堿色譜峰計(jì)算不低于3000。

1.2.2 溶液的配制

① 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：精密稱取五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h的原阿片堿對(duì)照品7.1 mg，置25 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻、靜置。既得原阿片堿濃度為284 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

② 供試品溶液的配制：精密量取夏天無(wú)滴眼液7.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，搖勻、靜置。即得原阿片堿濃度為281.25 μg/mL的夏天無(wú)供試品溶液。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

① 專屬性試驗(yàn)：在色譜條件下，分別記錄對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖。

② 線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋到刻度，搖勻，即得濃度為：14.2、28.4、42.6、56.8、71、85.2、99.4、113.6、142 μg/mL系列溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，將原阿片堿峰面積(A)與濃度(C)進(jìn)行回歸分析。

③ 精密度試驗(yàn)：選取低、中、高3種濃度的原阿片堿對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度。

④ 加樣回收率試驗(yàn)：分別精密量取夏天無(wú)滴眼液1 mL置于15個(gè)10 mL容量瓶中。精密量取原阿片堿對(duì)照品儲(chǔ)備液1.2、1.5、1.8 mL各5份，分別置于上述10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。

⑤ 耐用性試驗(yàn)：在試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相乙腈-0.1%三氟乙酸比例(23.7:76.3、25:75、26.3:73.7)、柱溫(25 ℃、30 ℃、 35 ℃)、 流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)條件進(jìn)行考察。

⑥ 樣品含量測(cè)定：精密吸取夏天無(wú)滴眼液，稀釋20倍，按照“1.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，將測(cè)得峰面積代入回歸方程按外標(biāo)法計(jì)算樣品中原阿片堿的含量。

⑦ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：以批號(hào)150301的夏天無(wú)滴眼液按“1.2.3⑥”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并于0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性考察結(jié)果：結(jié)果原阿片堿的保留時(shí)間約為6.2 min，樣品溶液中主峰與其余各峰分離效果較好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 原阿片堿對(duì)照品(A)和夏天無(wú)滴眼液(B)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of protopine standard sample(A) and rhizoma corydalis decumbentis eye drops (B)

2.2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果：原阿片堿峰面積(A)與濃度(C)進(jìn)行回歸分析，得到線性方程：A=28.2207C-36.1446(r=0.9999，n=9)。結(jié)果表明原阿片堿濃度在14.2～142 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果：低、中、高濃度的原阿片堿對(duì)照品溶液日內(nèi)精密度及日間精密度考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果：回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.2.5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)流動(dòng)相比例、柱溫、流速發(fā)生細(xì)微變化時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小，主吸收峰與其它吸收峰均能夠達(dá)到基線分離，表明本方法耐用性較好。

2.2.6 樣品含量測(cè)定結(jié)果：樣品中原阿片堿的含量見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：原阿片堿供試品0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣，其峰面積的RSD為0.55%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

流動(dòng)相選擇上本研究嘗試使用了以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%三氟乙酸和甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示使用乙腈-0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相，色譜峰形、對(duì)稱性好，無(wú)需加入緩沖液，且三氟乙酸較三乙胺粘度低，可以較方便地從制備樣品中除去。原阿片堿的保留時(shí)間是6.2 min，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的原阿片堿保留時(shí)間12.6 min相比，可以縮短原阿片堿的保留時(shí)間，提高了分析的效率。

本研究建立了高效液相色譜測(cè)定夏天無(wú)滴眼液中原阿片堿含量的方法，采用樣品稀釋后直接進(jìn)樣，流動(dòng)相不需用三乙胺調(diào)節(jié)，更為簡(jiǎn)化。在不影響分離效果的情況下原阿片堿出峰時(shí)間縮短,提高了工作效率，方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，為該藥品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1] 羅躍華，熊蔚，許妍，等.薄層掃描法測(cè)定夏天無(wú)中原阿片堿的含量[J].中草藥，2000，31(9)：669-670.

[2]羅躍華，熊蔚，吳朝陽(yáng).薄層掃描法測(cè)定夏天無(wú)片中原阿片堿的含量[J].中成藥，1999，31(10)：531-532.

[3]姜舜堯，宋景政，周明昊，等.高效毛細(xì)管電泳測(cè)定夏天無(wú)藥材中延胡索乙素的含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2000，35(5)：336-337.

[4]文懷秀，邵赟，陶燕鐸，等.RP-HPLC法測(cè)定藏藥細(xì)果角茴香中原阿片堿的含量[J].藥物分析雜志，2009，29(1)：137-139.

[5]竇志英，孫巍，田麗莉,等.HPLC法比較延胡索生品與不同炮制品中3種有效成分的含量[J].中藥材，2007，30(4)：399-401.

[6]顧孝紅，唐平，靳祖英.反相高效液相色譜法測(cè)定夏天無(wú)中原阿片堿的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2002，13(10)：608-609.

[7]潘成學(xué)，劉偉，申小靜.HPLC測(cè)定夏天無(wú)膠囊中原阿片堿的含量[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，40(4)：721-722.

[8]朱才慶，范其坤，熊勝泉,等.HPLC法測(cè)定夏天無(wú)注射液中原阿片堿[J].中草藥，2005，36(5)：699-700.

[9]沈燕，韓超，夏碧琪,等.高效液相色譜法測(cè)定夏天無(wú)中4種生物堿的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(15)：2110-2112.

[10]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)2015版[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1342.

[11]沈燕，韓超，劉翠平,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定夏天無(wú)中的4種生物堿[J].色譜，2011，29(2)：176-179.

[12]周利賢.HPLC法測(cè)定夏天無(wú)注射液中原阿片堿的含量[J].中國(guó)藥師,2010，13(10)：1454-1455.

(編校：王儼儼)

Determination of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops by HPLC

CAI Yong-hao, XU Xue-gu, LIN Pei-zhen, YU Yin-feiΔ

(Department of Pharmacy,The Affiliated Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of content of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops.MethodsThe HPLC separation was carried out on a ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)column，the mobile phase was acetonitrile-0.1%TFA solution(25:75) with the velocity of 1 mL/min and the column temperature of 30 ℃，the detection wavelength was set at 290 nm.And the injection volume was 20 μL.ResultsThe good linearity of protopine under chromatography was found of 14.2-142 μg/mL (r=0.9999,n=9),The average recovery rate was 104.5% with RSD of 2.47%,Both intra- and inter-day precision RSD were less than 1%(n=5).The samples were stable in 24 h.ConclusionThe method is simple,accurate and repeatable,it can be used for the quality control of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops.

rhizoma corydalis decumbentis eye drops; protopine; HPLC; content determination

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.58

溫州市公益性科技計(jì)劃(Y20150372)

蔡永豪，男，本科，主管藥師，研究方向：眼用藥物制劑研究，E-mail：cyh@mail.eye.ac.cn；郁引飛，通信作者，男，本科，主任藥師，研究方向：眼用藥物制劑研究，E-mail：wz88068866@163.com。

R286.0

A